[发明专利]用于鉴定小麦春化基因VRN-D4的试剂盒及其专用成套引物对

说明书

本发明公开了用于鉴定小麦春化基因VRN‑D4的试剂盒及其专用成套引物对。本发明用于鉴定VRN‑D4基因的成套引物对由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成。本发明针对VRN‑D4基因编码区第367位碱基变异重新设计1个CAPS标记，使扩增的目的片段内只含有一个限制性内切酶的酶切位点，以便达到缩短酶切时长和降低试剂成本的目的。本发明开发了该基因更加简便、快速、可靠、实用的分子标记，对小麦育种、引种和推广具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定小麦春化基因VRN-D4的试剂盒及其专用成套引物对。

背景技术

近百年来，全球气候正在经历着一次以变暖为主要特征的显著变化，气候变化已成为当今科学界、各国政府和社会公众强烈关注的重大环境问题之一。小麦是我国乃至世界上重要的粮食作物之一，气候变化给小麦的育种和生产工作提出了新的挑战和机遇。培育和推广能够适应外界环境变化、最大限度利用光热资源的品种，是夺取小麦高产和稳产的最经济最有效途径。通过调整小麦生长发育阶段使其更好的适应外界生长环境条件，只有这样才能够最大限度地降低作物减产风险从而确保小麦丰产。研究认为，不同地理气候条件下小麦生长发育适应性主要受春化基因(VRN)、光周期基因(PPD)及早熟基因(EPS)控制，其中春化基因对小麦生长发育适应性影响最大，贡献率约占70-75％。

在冬小麦的生长发育进程中，必须要经历一段时期的低温处理，才能够抽穗开花，这个过程叫春化作用。小麦的春化作用是由四种春化基因VRN1、VRN2、VRN3和VRN4控制。与野生型等位变异相比，春化基因特定区域序列变异的等位变异使小麦品种的冬春习性发生改变，不同春化基因型决定小麦冬春习性强弱程度差异，使得完成春化过程所需低温时间也就不同，造成生长发育的进程不同，具备不同的生长习性，表现出小麦品种不同的抗冻害特性。已有研究表明，不同国家或地区的小麦具有不同春化基因组成类型，不同的春化基因组成类型与不同地区自然环境有关，是小麦适应环境能力的遗传基础，即不同国家或地区推广的小麦品种具备特定春化基因的组成类型。早在2000年Iwaki等就报道，中国小麦存在VRN-D4基因；随后Zhang等(2008)研究也证实我国小麦存在VRN-D4基因。Kippes等(2015)认为VRN-D4是小麦重要的春化基因之一，其可以增加小麦遗传的多样性，增强小麦适应不同生态地区和气候变化能力。

与前三个春化基因VRN1、VRN2和VRN3相比，VRN4的研究相对滞后，近年来在小麦5D染色体上才克隆了VRN4基因，被命名为VRN-D4基因。该基因与SSR的分子标记Xcfd78和Xbarc205紧密连锁，与Xcfd67和BG313707标记存在共分离现象，此共分离标记常被用来作为VRN-D4基因的鉴定标记使用，但在实际检测过程当中发现有些材料却无法使用共分离标记得到有效的鉴别。进一步研究发现，VRN-D4其实是VRN-A1基因的1个拷贝基因，起源于小麦的5AL大片段插入5DS、所插入的片段中恰好包含了1个VRN-A1基因，只是在第一内含子区域和编码区第四外显子区域存在有两个功能结构域的变异。因此，前人对VRN-D4基因进行鉴定的时候，需要同时检测5DS区域是否存在5AL大片段的插入和编码区是否存在特定碱基的变异。与VRN-A1基因序列相比，VRN-D4基因在第1内含子区域存在有3个邻近的特异性SNP(G2780C、T2783C、C2784T)，而此位点区域正好属于一个开花抑制因子TaGRP2识别的保守区域RIP-3，由于该区域SNP多态性的改变使得开花抑制因子TaGRP2无法与该基因结合，导致携带春化基因VRN-D4小麦能够提早抽穗开花。同时，与VRN-A1序列相比，VRN-D4基因在第四外显子上第367位碱基存在有1个单碱基突变(A367C)，该处碱基的变化会导致氨基酸序列的变化(由原来的赖氨酸变成谷氨酰胺)，而此位点属于MADS转录因子的K-Box结构域，与植物生长发育进程密切相关。