[发明专利]一种拉链式可延伸探针在cfDNA文库构建中的应用

说明书

本发明公开了一种使用拉链式可延伸探针的cfDNA文库构建方法，包括：获得拉链式探针，其3’端包括与目标DNA单链互补配对的15‑20个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18‑50个，所述颈环结构的环部从5’‑3’方向包括A和U碱基；将DNA样品打断成片段，变性成单链DNA；所述拉链式探针与变性后的单链DNA进行连接反应，然后进行延伸并在延伸链的3’端加上A，形成末端封闭的双链DNA复合物；在进行剪切，形成平末端3’都带有A的双链DNA；将所述双链DNA与接头连接；对所述连接接头的双链DNA进行探针捕获；对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。

技术领域

本发明属于生物技术，更具体地，本发明提供了一种拉链式可延伸探针在cfDNA文库构建中的应用。

背景技术

在标准的大规模平行测序中，很难检测到丰度低于2％的突变。要想检测到这些低频突变，需要检测到大量的读段数，这样会直接给测序成本带来极大地提升。这正是目前对血液中ctDNA检测的瓶颈所在。1ml血浆中有1,800-13,000个cfDNA片段，然而ctDNA占有cfDNA含量在0.4-11％。仅通过常规建库测序方法会使ctDNA检测信号完全淹没在背景噪声中，其原因在于，在通常建库过程中，在对末端cfDNA修复的过程中，会在内切酶的作用下切掉3’端序列。并且cfDNA片段化过程不像基因组打断那样随机，如果突变位置发生在cfDNA的3’的近端，按照常规的建库方法，将无法检测到突变位点信息。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种使用拉链式可延伸探针的cfDNA文库构建方法，所述方法包括：

(1)获得拉链式探针，所述拉链式探针的3’端包括与目标DNA单链互补配对的15-20个碱基，优先选择16个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18-50个，优选20个，所述颈环结构的环部从5’-3’方向包括A和U碱基；

(2)将DNA样品打断成片段，变性成单链DNA；

(3)所述拉链式探针与变性后的单链DNA进行连接反应，将连接产物进行延伸，并在延伸链的3’端加上A，形成末端封闭的双链DNA复合物；

(4)将双链DNA复合物剪切，形成平末端3’都带有A的双链DNA；

(5)将所述双链DNA与接头连接；

(6)对连接接头的所述双链DNA进行探针捕获；

(7)对所述捕获序列进行测序，获得捕获序列的测序结果。

在一个实施方案中，在(3)中在Klenow片段的作用下进行延伸。

在一个实施方案中，在(4)中在USER酶的作用下进行剪切。

在一个实施方案中，在(5)中所述接头包括分子标签。

在一个实施方案中，在(1)中所述拉链式探针的序列如下：从5’-3’为颈环部分序列+AU+与颈环部分互补序列+与目标区域互补序列：

ACGGTATTGA++AU+TCAATACCGT+与探针互补序列。

在一个实施方案中，在(6)中包括对所述捕获产物测序的步骤。

在第二方面，本发明还提供了一种拉链式探针，所述拉链式探针的3’端包括与目标DNA单链互补配对的15-20个碱基，优先选择16个碱基，5’端包括颈环结构，所述颈环结构中互补配对的碱基数目为18-50个，优选20个，所述颈环结构的环部从5’-3’方向包括A和U碱基。

在一个实施方案中，拉链式探针序列从5’-3’为颈环部分序列+AU+与颈环部分互补序列+与目标区域互补序列：

ACGGTATTGA++AU+TCAATACCGT+与探针互补序列。