[发明专利]一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒，特点是包括9种食源性致病菌的LAMP检测引物组，特点是基因序列如SEQ ID NO.1～NO.36所示，还包括样品模板、10×反应缓冲液、MgSO₄、dNTP、BstDNA聚合酶和双蒸水，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低和无假阴性结果。

技术领域

本发明涉及一种食源性致病菌检测试剂盒，尤其是涉及一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒。

背景技术

食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。致病性细菌直接或间接污染食品及水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽传染病的流行。食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病菌主要有痢疾杆菌，致病性大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌。传统的微生物检验方法是培养分离法，依靠培养基进行培养、分离及生化鉴定。试剂盒法：在检测装置的样品孔中加入一部分富集培养物，样品沿检测装置流动，出现易于区分的可见结果。如果只在对照区形成一个条带，则样品为阴性；在对照区和检测区同时出现条带，则可初步鉴定样品为阳性。测试片法：将选择性培养基中加入专一性的酶显色剂，并将其加载中纸片上，通过培养，如果样品中含有金黄色葡萄球菌，即可在纸片上呈现紫红色的菌落。微生物专有酶法：产生β-半乳糖苷酶可以分解液体培养基中的酶底物——4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷，使4-甲基伞形酮游离，因而在366nm的紫外光灯下呈现蓝色荧光。试纸片法：试纸片为预先制备好的培养基系统，它含有标准培养基、冷水可溶性凝胶和指示剂，便于菌落计数。细菌总数测试片检样后37℃培养（48±3）h，阳性菌落在测试片上为红色或粉红色，与测试片底色有较大反差，容易判别计数。但这些方法只能半定性或者细菌总数。因此，亟需一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒，实现快速定量检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒，包括9种食源性致病菌的LAMP检测引物组，其基因序列如下表1所示：

表 1

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所述的检测试剂盒的LAMP反应体系及各成分的终浓度如下：样品模板DNA 1μL，2.5μL 10×反应缓冲液，1.5μL浓度为100mM 的MgSO₄，3.5μL 浓度为10mM 的dNTP，1μL浓度为8 U/μl Bst DNA 聚合酶，1μL FIP/BIP引物组溶液，1μL F3/B3引物组溶液和4μL甜菜碱，然后用双蒸水补足25μL；其中所述的FIP/BIP 引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的FIP/BIP引物组溶液，各引物终浓度均为40 μM，所述的F3/B3引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的F3/B3引物组溶液，各引物终浓度均为5 μM。

所述的检测试剂盒还包括显色剂，所述的显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液或者SYBR-Green I，其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75μM，氯化锰浓度为 500μM；所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150μM，所述的钙黄绿素/氯化锰溶液或者所述的羟基萘酚蓝溶液的添加量为1μL/孔，所述的SYBR-Green I显色剂的添加量为5μL/孔。