[发明专利]一套快速定性、定量检测六种肠道微生物的引物组及其应用

说明书

本发明公开了一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成。应用此引物组进行PCR检测结合琼脂糖凝胶电泳可对样品进行定量分析；应用此引物组进行荧光定量PCR检测可对样品进行定量检测。本发明设计的引物组可在同一PCR反应程序下进行，四小时内实现对肠道中六种常见微生物进行定性、定量检测，在医疗检测和食品卫生等领域应用前景广阔。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组及其应用。

背景技术

肠道是人体最为重要的消化器官，也是一个多元化并充满活力的微生物生态系统，寄居着数万亿的微生物。大量研究表明，肠道微生物不仅参与宿主的食物转化，对于机体的神经、免疫等生理功能也具有重要的作用。宏基因组测序发现，在肠道中占优势地位的细菌主要分布于拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和变形菌门中，其中包括拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属等常见的肠道微生物；这些微生物的组成与数量保持动态平衡，同时机体内外的多种因素可能会改变这种平衡，进而影响宿主的生理状态。因此，快速准确地跟踪肠道中常见肠道微生物的组成变化对于监测机体健康具有重要意义。

目前对于肠道微生物组成的鉴定主要通过宏基因组测序完成，过程较为复杂，耗时耗力，且花费较多；利用种属特异性引物进行PCR检测和实时荧光定量PCR检测，能够更为快速地实现肠道微生物的定量检测。目前已有的种属特异性检测引物大多以疾病相关的肠道菌作目标菌，针对性强，但普适性较差，且每种引物有单独的检测程序，退火温度与延伸时间不能统一，无法进行同批次实验，过程繁琐。

申请人基于拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属以及与其亲缘关系较近的其他菌的16S rRNA基因序列相似性比对，获得了各目标菌区别于其他五种菌以及相近菌的特异性保守序列，并根据该保守序列设计了六组特异性引物对，同时所述的引物组可在同一PCR反应程序下，四小时内实现对肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的微生物进行定性、定量检测，且不涉及价格高昂的试剂和设备。经检索，有关这种能快速定性、定量检测肠道中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的特异性引物组及其应用的专利还未见报道。

发明内容

针对现有方法不足，本发明要解决的问题是提供一套快速定性、定量检测六种微生物的引物组及其应用。利用该引物组通过PCR反应可以便捷、准确地检测样品中拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属六种肠道微生物的存在及数量。

本发明所述的一套快速定性、定量检测六种常见肠道微生物的引物组，由分别用于检测拟杆菌属、乳杆菌科、大肠杆菌、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属的六组特异性引物对组成；

其特征在于：

所述用于拟杆菌属检测的引物对是上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6，该对引物扩增获得135bp拟杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中，所述上游引物Bacter F5与下游引物Bacter R6的核苷酸序列为：

上游引物Bacter F5：5’-AAGACAACGATGGATAGGGGTT-3’，

下游引物Bacter R6：5’-TTCACGCTACTTGGCTGGT-3’；

所述用于乳杆菌科检测的引物对是上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6，该对引物扩增获得322bp乳杆菌基因组DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述上游引物Lacter F5与下游引物Lacter R6的核苷酸序列为：

上游引物Lacter F5：5’-ACAATGGACGCAAGTCTGATG-3’，