[发明专利]一种检测KRAS基因外显子2密码子12/13突变的试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及生物医学核酸检测试剂盒技术领域，具体为检测KRAS基因外显子2密码子12/13突变的方法及试剂盒的研发。试剂盒包括：PCR扩增引物，Taq‑man探针，数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照；该试剂盒价格低廉，操作简单，可重复获取，基于微滴式数字PCR技术平台，由于其仅须一次PCR反应即可同时检测KRAS最常见的密码子12和13位点的多种缺失类型，可明显减少试剂、耗材的消耗，单次检测的成本仅为其他微滴式数字PCR的1/8。以前技术方法的灵敏度一般在1％‑50％之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，为1/1000。同时提供该试剂盒的检测方法，为个体化用药提供参考。

技术领域

本发明涉及生物医学核酸检测试剂盒技术领域，具体为检测KRAS基因外显子2密码子12/13突变的方法及试剂盒的研发，同时提供其制备方法。

背景技术

随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因的特定位点突变已经成为指导靶向治疗用药的先决条件。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。

肿瘤发生和发展受癌基因驱动。在众多癌基因中，RAS基因家族在人类肿瘤中突变概率最高，被视为癌基因领域中的'珠穆朗玛峰'。RAS突变肿瘤占人类所有恶性肿瘤的三分之一，其中KRAS作为RAS基因家族中的主要亚型，促发人类多种致死性肿瘤，如肺癌、结肠癌和胰腺癌。然而，由于KRAS信号通路调控的复杂性以及KRAS突变肿瘤对临床药物的抵抗性，使得目前临床上仍无治疗KRAS突变肿瘤的有效药物和方法。KRAS突变型肿瘤是最具潜在靶向性的非小细胞肺癌分子亚型(NSCLC)。在NSCLC的病例中，KRAS突变主要发生在12和13号密码子。最常见的密码子变异约占KRAS突变型NSCLC的39%，是KRAS-G12C突变。其他常见突变包括KRAS- G12V(18-21%)和KRAS- G12D(17-18%)变体。

目前基因变异的检测技术主要有直接测序法（亦称Sanger 测序法）和ARMS 法。现分别简介于下：

测序法：测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高。聚合酶链式反应－单链构象多态性分析（PCR-SSCP）PCR-SSCP是一种比较经典的基因突变检测的方法，该方法可以对未知的突变进行检测。与测序法相比，PCR-SSCP灵敏性更高，操作简单，无需特殊仪器，还可以对未知的突变进行检测。ARMS 法也称扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、等位基因特性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等，即等位基因特异性扩增法（Allele SpecificAmplification，ASA，选择性地扩增野生型或突变型基因。

上述现有技术存在以下问题：价格昂贵，操作复杂，且一般需要通过有创性组织活检，同时不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA 中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法，用于癌症患者，特别是肺癌患者的靶向用药指导、高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测KRAS基因外显子2密码子12/13突变的试剂盒，该试剂盒价格低廉，操作简单，可重复获取，且能同时检测多种突变类型，同时提供该试剂盒的检测方法，为个体化用药提供参考。

本发明以美国伯乐微滴式数字PCR为平台，选择KRAS基因2外显子区域进行探针和引物的设计。所选择的2外显子密码子12/13突变的位点在KRAS 外显子2上c.5562-c.5566，此潜在的2外显子密码子12/13突变区域涵盖以下突变的类型见表1：

表1 本发明可以检测的KRAS基因2外显子密码子12/13突变的类型