[发明专利]一种检测KRAS基因外显子2密码子12/13突变的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种检测KRAS外显子2密码子12/13突变的试剂盒，其特征在于，包括： PCR 扩增引物， Taq-man探针，数字PCR预混液、微滴生成油、阴性对照和阳性对照；

所述的PCR 扩增引物，包括反向PCR 扩增引物和正向PCR 扩增引物，可扩增含有KRAS外显子2上c.5522-c.5637 (116-bp amplicon)序列如SEQ No.1所示；

所述的PCR扩增引物序列如下：

上游引物序列如SEQ No.2所示；

下游引物序列如SEQ No.3所示；

参考探针序列如SEQ No.4所示；

位点探针序列如SEQ No.5所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的位点探针及参考探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、FAM、Cy5、Cy3或VIC；

所述的猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的数字PCR预混液主要成分包含TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR buffer、PCR反应增强剂、稳定剂。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为5 μM~15 μM，在最终反应体系中的浓度为400 nM~1200 nM。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的位点探针和参考探针的使用浓度为5 μM~25 μM，在最终反应体系中的浓度为100 nM~500 nM。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照来源于携带KRAS基因野生型的非小细胞肺癌细胞H1975；阳性对照来源于携带KRAS基因2外显子密码子12/13突变的阳性细胞人结肠癌细胞SW480或HCT-116。

8.一种权利要求所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）DNA提取：提取含有KRAS基因2外显子密码子12/13突变的阳性细胞人结肠癌细胞SW480或HCT-116和KRAS基因野生型细胞H1975；

（2）数字PCR反应液制备；

（3）PCR反应微滴制备：将PCR反应液转移至微滴发生卡，在油孔中加入微滴生成油，制备微滴；

（4）PCR扩增：退火后，然后扩增反应；

（5）检测及计算突变率。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）包括：将待检测样品、PCR扩增上下游引物、无酶水、KRAS基因2外显子密码子12/13突变的位点探针和参考探针以及数字PCR预混液混合混合制备得到数字PCR混合液。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）的扩增反应过程为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，55℃～63℃退火/延伸60～120秒，，共进行20～60个循环，95℃～100℃酶失活8～16分钟，16℃无限循环。