[发明专利]利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法

说明书

本发明公开了一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：获取浮萍植株，剪取浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27‑29℃处理28‑30min，用组织酶解液在黑暗、25‑26℃条件下酶解浮萍植株的假根25‑30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，琼脂糖包埋原生质体，原生质体的裂解，单细胞凝胶电泳，染色及观察，在荧光显微镜下观察原生质体的彗星图像，当出现彗星拖尾现象判断为该原生质体DNA受损。本发明的方法首创了利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度，利用该方法可在短时间内检测浮萍原生质体DNA损伤程度。

本发明得到：国家自然科学基金青年项目(31700443)的资助。天津师范大学2018年市级创新训练项目(201810065031)。

技术领域

本发明属于单细胞凝胶电泳技术领域，具体来说涉及一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法。

背景技术

单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)又称彗星试验(comet assay)是近年来发展起来的可以在细胞水平检测真核细胞DNA损伤的一种遗传毒理分析技术,具有简便、快速、灵敏、样品用量少和无需放射性标记等特点。目前运用单细胞凝胶电泳技术检测动物或人细胞DNA损伤的研究国际上已有一些报道，但应用于植物细胞DNA损伤研究的尚不多见。若以动物或人体细胞为原材料进行单细胞凝胶电泳，其培养技术相对复杂，来源少、成本高；制备单个细胞时多数需要经过酶解或细胞剪切、匀浆，不可避免的对细胞造成一些伤害，而且所获细胞来源、尺寸不同，可能会影响结果的判断。另一方面，以往的以植物细胞为材料进行电泳，获得的彗星图像效率均不高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，该方法通过一定的方法处理使植物细胞质壁分离、降解细胞壁获取原生质体，进行悬浮培养，无酶学消化作用，具有快速、简便、成本低廉、结果准确等优点，有效的获取的浮萍原生质体进行单细胞凝胶电泳的彗星图像。本发明以单细胞凝胶电泳技术为手段检测萍原生质体DNA损伤程度，可用于探索重金属镉对植物遗传毒理效应的检测方法和实验体系，并为研究植物相应重金属胁迫的细胞和分子机理提供新的证据。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍(Lemnaturionifera)原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：

1)获取浮萍植株；

2)剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27-29℃处理28-30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L-150g/L；

在所述步骤2)中，所述假根的长度为2-5cm。

3)用组织酶解液在黑暗、25-26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍植株的假根25-30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，其中，在酶解过程中，每隔8-10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；所述组织酶解液的组成包括：

在所述步骤3)中，每次清洗所述原生质体的方法为：用A液垂直打入离心管，以使原生质体自动悬起，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液，其中，离心的温度为20-25℃，转速为2000-3000×g，时间为2-5min。

4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加150-200μL正常熔点琼脂糖凝胶制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温20～25℃保持至少10小时，以使正常熔点琼脂糖凝胶干燥，移除所述盖玻片；将60-70μL低熔点琼脂糖凝胶与30-40μL步骤3)所得原生质体混合，滴加在所述第一层胶上，再次加盖盖玻片，于4℃固化10-20min；