[发明专利]利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法

权利要求书

1.一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)获取浮萍植株；

2)剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27-29℃处理28-30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L-150g/L；

3)用组织酶解液在黑暗、25-26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍植株的假根25-30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，其中，在酶解过程中，每隔8-10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；所述组织酶解液的组成包括：

4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加150-200μL正常熔点琼脂糖凝胶制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温20～25℃保持至少10小时，以使正常熔点琼脂糖凝胶干燥，移除所述盖玻片；将60-70μL低熔点琼脂糖凝胶与30-40μL步骤3)所得原生质体混合，滴加在所述第一层胶上，再次加盖盖玻片，于4℃固化10-20min；

5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用所述纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解55-65min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h，PBS缓冲液的组成包括：

K₂HPO₄·3H₂O 11-12g/l

KH₂PO₄ 6-8g/l

溶剂为去离子水

所述碱性裂解液的组成包括：

NaCL 146-146.5g/l

Na₂EDTA 37-37.5g/l

Tris(三羟甲基氨基甲烷) 1-1.5g/l

溶剂为去离子水

其中，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h前加入该碱性裂解液质量10-11wt％的DMSO(二甲基亚砜)和1-2wt％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)并均匀混合；

6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片3-5次，置于水平电泳槽内，加入Ph为13-15的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育28-35min后进行电泳，电泳条件如下：电压为20-25V，电流为300-350mA，电泳时间为30-35min；

7)染色及观察：从水平电泳槽中取出载玻片，用PBS缓冲液漂洗3-5次，每次3-5min，漂洗后用SYBR Gold对所述原生质体染色；

8)在荧光显微镜下观察步骤7)得到原生质体的彗星图像，当出现彗星拖尾现象判断为该原生质体DNA受损。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述假根的长度为2-5cm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，每次清洗所述原生质体的方法为：用A液垂直打入离心管，以使原生质体自动悬起，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液，其中，离心的温度为20-25℃，转速为2000-3000×g，时间为2-5min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，所述低熔点琼脂糖凝胶由低熔点琼脂糖与去离子水组成，低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，所述正常熔点琼脂糖凝胶由正常熔点琼脂糖和去离子水组成，正常熔点琼脂糖凝胶中正常熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤5)中，所述碱性裂解液的pH为9.8-10.2。