[发明专利]来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用

说明书

本发明公开了来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用。本发明应用来自弧菌属的碱性几丁质酶对真菌进行染色，能够靶向地特异性与真菌细胞壁的几丁质结合，在荧光显微镜下观察，用340nm‑400nm的紫外光激活，真菌将显示出蓝色或黄绿色。

技术领域

本发明属于病原菌生物学检验技术领域，具体涉及来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用。

背景技术

真菌容易引起真菌性皮肤病。当真菌侵犯人体后，医生将按它们对人体的侵犯部位来划分，因此真菌可分为浅部真菌和深部真菌两大类。浅部真菌(癣菌)仅侵犯皮肤、毛发和指(趾)甲，而深部真菌能侵犯人体皮肤、黏膜、深部组织和内脏，甚至导致严重败血症、心内膜炎、脑膜炎等致死性疾患。

现代医学临床检验中，对浅部真菌感染的诊断主要依赖于临床样本的真菌直接镜检和培养。在传统真菌感染的诊断中，KOH湿片镜检法是最简单、最经济的方法，但该法的准确检测需要有经验的检验工作者，易把细胞壁、纤维误认为菌丝，把气泡和油滴误认为孢子。且KOH湿片镜检法不具备特异性，容易受到杂质的影响。

随着真菌荧光染色法的推广，利用荧光染色液中荧光素与真菌细胞壁上多糖的非特异性结合发出荧光，从而观察判别真菌的存在。适用于皮屑、甲屑、毛发、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各种样本。但该方法仍不具备特异性，易受到染色底物杂质的干扰，且荧光衰退快。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种真菌的染色方法。

本发明的再一目的在于提供一种真菌染色液。

本发明的技术方案如下：

来自弧菌属的碱性几丁质酶在真菌染色中的应用，上述几丁质酶在pH＝10.0的Tris-HCl中的酶活力为0.2-0.8U/mL，在pH＝9.0的Tris-HCl中的酶活力为0.6-3.0U/mL，在pH＝8.0的Tris-HCl中的酶活力为0.4-1.2U/mL，在pH＝7.0的Tris-HCl中的酶活力为 0.1-0.6U/mL，以使每毫升碱性几丁质酶酶液每min产生1微摩尔的乙酰氨基葡萄糖的酶的量即为1个酶活单位U。

在本发明的一个优选实施方案中，所述碱性几丁质酶来自Vibrio campbellii、Vibrio cholerae或Vibrio parahaemolyticus，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO 01至03所示。

本发明的另一技术方案如下：

一种真菌的染色方法，包括如下步骤：

(1)将来自弧菌属的碱性几丁质酶与羧基荧光微球偶联，制得碱性几丁质酶偶联羧基荧光微球悬液；

(2)将碱性几丁质酶偶联羧基荧光微球悬液与其他组分混合，制成染色液，其中，其他组分包括伊文思兰、丙三醇和纯化水；

(3)将步骤(2)所制得的染色液对真菌进行染色，于荧光显微镜下用340nm-400nm的紫外光激活后观察。

在本发明的一个优选实施方案中，所述碱性几丁质酶来自Vibrio campbellii、Vibrio cholerae或Vibrioparahaemolyticus，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO 01至03所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述染色液中，所述羧基荧光微球、伊文思兰、丙三醇和纯化水的比例为0.8-1.2mg∶0.18-0.22g∶14-16mL∶80-90mL，所述碱性几丁质酶与羧基荧光微球的质量比为1∶8-11。

在本发明的一个优选实施方案中，所述其他组分还包括KOH。进一步优选的，KOH在所述染色液中的含量为5-20％(W/V)。