[发明专利]实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法

说明书

本发明公开了一种基于光学手段实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法，属于实时动态分析技术领域。本发明旨在提供一种实时监测孢子发芽过程、获知大量单个孢子发芽动态、获知孢子发芽异质性的方法。本发明的方法是采用光学成像分析单个微孢子虫孢子人工发芽的动态并通过拉曼光谱加以验证。本发明方法操作简便，无需染色，无环境污染，能够实时快速直观监测单个微孢子虫孢子的发芽过程，是一种研究微生物单细胞生理机制的简便、可行的实时监测方法。

技术领域

本发明属于实时监测技术领域，具体涉及一种基于光学成像手段实时监测单个微孢子虫孢子发芽动态和过程的方法。

背景技术

微孢子虫（Microsporidia）是一类细胞内专性寄生单细胞真核生物，目前将其归类为真菌，寄主很广泛，可以感染包括人类在内的无脊椎动物和脊椎动物，目前已发现有200多属，1400余种^[1-3]。其中，家蚕微孢子虫是人类最早发现的微孢子虫，主要寄生于家蚕，引起家蚕微粒子病对家蚕具有很强的危害性，被各国列为蚕种生产唯一的检疫病害^{[4, 5]}。近十多年来, 人们发现在免疫缺陷患者体内微孢子虫是重要的肠道致病病原, 由此在生物学和医学上“微孢子虫”已引起人们的广泛关注, 有关微孢子虫的研究和报道越来越多^{[6, 7]}。

微孢子虫孢子分为水生型和陆栖型两种, 两类孢子发芽过程中的海藻糖代谢途径不同, 这种差异可能源自内部海藻糖酶的不同，由此推测两类孢子的发芽可能由不同的机制诱导。已有的研究显示，水生型微孢子虫孢子人工发芽的机制是碱性缓冲液的预处理改变了孢子原生质膜的选择透性, 加大了孢子壁对阴、阳离子等发芽刺激因子的通透性,使外界刺激因子通过被动或主动方式进入孢子, 与原先存在于孢子内部膜结构上起骨架支撑作用的Ca²⁺争夺结合位点。随着外界刺激因子在竞争中逐渐占据优势, 并最终将Ca²⁺置换下来, 从而引起孢子膜结构的损伤和机械紊乱，进而打破海藻糖与海藻糖酶间的隔膜, 在合适的温度、pH 值、渗透压等条件下, 酶活性被激发并进一步提高, 催化海藻糖水解为葡萄糖或果糖, 孢子内渗透质浓度上升。外界水分在渗透势差的作用下大量进入孢子，极膜层和后极泡吸水膨胀, 压迫极丝解螺旋, 并从弱化了的极帽处弹出, 完成发芽过程^[8]。其中，海藻糖酶因催化海藻糖水解为葡萄糖或果糖而发挥重要作用，温度、pH 值、渗透压等各种因子有可能直接或间接地影响海藻糖酶的活性, 进而促进或抑制孢子发芽的。影响发芽的因素还包括各种阴离子与阳离子及其浓度、温度和射线、不同发芽方法及发芽培养基等^[8-10]。

微孢子虫侵染寄主是以其孢子发芽为基础，已经发芽的孢子基本上没有侵染力，而孢子发芽受到很多因素的影响。因此，认识其发芽机制及其萌芽影响因子，促使孢子在体外发芽或者抑制孢子发芽是阻断或降低微孢子虫侵染寄主的极其有效的手段。然而，上面所述是水生型孢子的发芽机理, 而对于陆栖型孢子，其发芽机理还不清楚，虽然对其发芽机制与发芽条件一直在探索，但都没有获得突破性进展^[11]。

另一方面，以往对孢子的研究，应用的是常规的群体分析方法，得到的是反映群体孢子平均信息的认识，掩盖了具体的单个孢子的个体信息。大量的研究显示，包括微孢子虫在内的众多微生物细胞拥有遗传或非遗传的细胞间差异化能力，这种固有的遗传和表型可塑性是微生物细胞能够适应并生存于逆境或持久生存并致病的基础^[12-14]。生物细胞间表现出的这种遗传或非遗传的细胞间差异就是生物细胞的异质性（Heterogeneity）。单细胞分析技术的发展，为认识细胞间的异质性提供了可能，促进了细胞生物学研究向更深更宽的领域迈进^[15]。初步实验表明，Nb孢子萌芽也存在异质性：在同样的环境条件下，部分孢子在几分钟内就发芽了，有些孢子则可能在几小时或者几天后才发芽。因此，通过单细胞分析了解微孢子虫孢子发芽的异质性及其影响因子，设法让微孢子虫孢子在基本相同的时间内发芽或者抑制其发芽，阻断或降低其侵染的机会，在农业、渔业乃至医学领域都具有特别重要的意义。