[发明专利]一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法

说明书

本发明涉及一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C，所述突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。本突变体比野生型肝素酶I(BtHepI)具有更好的热稳定性，有效降低了突变文库的筛选工作量，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义，提高肝素酶I在工业上的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程技术领域，尤其是一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法。

背景技术

肝素(Heprain)是一种特异性质多分散的混合硫酸化多糖，广泛分布于哺乳动物组织中，以共价键形式和蛋白质结合。目前商业肝素主要是从牛肺和猪小肠黏膜中提，结构复杂且具有多种重要的生物学功能，一般在临床上用于血栓、心血管等疾病的治疗。低分子量肝素(Low molecular heparin,LMWH)是肝素通过某些物理化学方法裂解而产生的一小段肝素，与蛋白质或细胞结合的能力有所下降，但抗凝活性显著增加。与正常肝素相比，低分子肝素可降低抗因子IIa的活性，极大程度地减小了出血的危险性。目前，制备低分子肝素有物理、化学、生物和合成方法。其中，生物酶解法由于具备条件温和、选择性强、污染小等优点，现已成为一种新兴的方法。

肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一类能够裂解肝素类结构物质、制备低分子肝素的多糖裂解酶，来源比较广泛，主要存在于原核生物肝素黄杆菌中，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等。肝素酶I首先发现于肝素黄杆菌，可选择性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α(1-4)糖苷键。根据肝素酶I的各个来源的氨基酸序列以及蛋白结构特点，肝素酶I被划分为糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要应用于低分子肝素的制备、体外循环中肝素的消除、肝素确切结构的解析、以及在体外诊断试剂方面用于凝血试验和血小板实验

目前肝素酶I的热稳定性很差，导致其无法很好地适应工业化应用。这已经是阻碍酶法制备低分子肝素的瓶颈。二硫键已经报道是稳定酶结构的很重要的成分，因此通过Dsulfide scan突变扫描，构建肝素酶I二硫键突变体文库。与传统的定向进化筛选热稳定性肝素酶I的方法相比，具有筛选工作量小，速度快等等优势。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法(CN106497897A)，涉及一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。依照肝素酶I的空间结构分析对其氨基酸序列进行优化，获得比酶活提高48％的Hep169。然后根据密码子偏爱性优化HepI169基因，通过人工合成获得基因DNA，克隆到表达载体中与SUMO等标签进行融合表达，转化宿主细胞、筛选建立了Hep169的可溶性基因工程表达生产体系，分析结果显示目的蛋白获得了高效的可溶性表达，且具有很好的生物学活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本发明方法不仅提供了一种高活性的HepI，而且为肝素酶I的高效可溶性基因工程表达生产提供了一种新方法，可有效降低低分子肝素等药物的生产成本，具有广泛的应用前景。

通过对比，本发明申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法、活性测定方法，该突变体比野生型肝素酶I(BtHepI)具有更好的热稳定性，有效降低了突变文库的筛选工作量，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义，提高肝素酶I在工业上的应用价值。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C，所述突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。