[发明专利]一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法

权利要求书

1.一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。

3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组质粒。

4.一种包含如权利要求2所述的编码基因的转化子。

5.一种如权利要求1所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的制备方法，其特征在于：步骤如下：

利用定点突变技术，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突变；经测序正确后，转化大肠杆菌Rosetta（DE3）；经诱导表达并分离纯化出热稳定性提高的 肝素酶I突变体。

6.根据权利要求5所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的制备方法，其特征在于：所述方法中使用的表达载体为原核表达质粒。

7.根据权利要求5所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的制备方法，其特征在于：含突变基因BtHepI^D204C/K208C表达工程菌的构建具体步骤如下：

设计2对突变引物：D204C-F、D204C-R；K208C-F、K208C-R，所述D204C-F、D204C-R；K208C-F、K208C-R序列为：

D204C-F：SEQ ID NO.3；

D204C-R：SEQ ID NO.4；

K208C-F：SEQ ID NO.5；

K208C-R：SEQ ID NO.6；

以含有野生型BtHepI基因的质粒 pE-SUMO-BtHepI 为模板，使用以上引物进行两轮PCR，反应条件为：95℃ 2min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 7min，30个循环；72℃ 5min；对其PCR产物进行DnPI酶消化，进行核酸电泳以及切胶回收，将其转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选提取阳性克隆子的质粒送去测序；将测序正确的表达质粒pE-SUMO-BtHepI^D204C/K208C转化入大肠杆菌Rosetta（DE3）中，成功构建BtHepI突变体的表达工程菌；

经诱导表达并分离纯化出热稳定性提高的 肝素酶I突变体。

8.一种如权利要求1所述的通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体BtHepI^D204C/K208C的活性测定方法，其特征在于：步骤如下：

以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性；反应体系为在1.5 mL 的EP管中加入100 μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50 mmol/L 醋酸钠，5 mmol/L 醋酸钙，5 mmol/L 肝素钠的混合物，金属浴中40 ℃恒温孵育10 min，加入纯化后浓度为20-25ug/ml的酶液10 μL，反应10min，立即加入0.06 mol/L 盐酸1 mL终止反应；在12000 r/min 条件下离心5 min，取上清液测定其在232 nm的吸光值。