[发明专利]一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法

说明书

本发明公开一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法，包含以下操作步骤：血清制作：将血液放入至离心机内进行离心操作，并取出血清部分备用，抗生素液制作：分别将100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ug/ml卡那霉素和25ug/ml制菌霉素以1：2：1：3的比例充分混合，以此制得抗生素液备用。该人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法，使用多种盐溶液和抗生素作为辅助生长剂，使用较为普遍的牛犊血清作为基础，同时采用添加NaHCO3和HEPES溶液的方式调节培养液的PH值，给卵母细胞提供生存条件的同时抑制了杂菌的生长，避免了由于杂菌感染而导致的研究困难，同时提高了卵母细胞的体外成熟率，降低了制造成本，降低研究难度的同时方便了使用者的使用。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法。

背景技术

卵母细胞在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞，分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物，在卵母细胞研究过程中，需要对卵母细胞进行体外培养操作。

在现有技术中，所使用的培养液适用于过多种类的杂菌生存，因此容易出现由于杂菌感染而导致的研究困难，同时降低了卵母细胞的体外成熟率，所使用的培养液的所需材料中多为现成的生物体液提取加工而成，因此制造成本较高，增加研究难度的同时给使用者的使用带来不便。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法和培养方法，解决了在现有技术中，所使用的培养液适用于过多种类的杂菌生存，因此容易出现由于杂菌感染而导致的研究困难，同时降低了卵母细胞的体外成熟率，所使用的培养液的所需材料中多为现成的生物体液提取加工而成，因此制造成本较高的问题。

（二）技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种人卵母细胞的体外成熟培养液制备方法，包含以下操作步骤：

S1、血清制作：将血液放入至离心机内进行离心操作，并取出血清部分备用；

S2、抗生素液制作：分别将100ug/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ug/ml卡那霉素和25ug/ml制菌霉素以1：2：1：3的比例充分混合，以此制得抗生素液备用；

S3、离子液制作：分别将75IU/L rFSH、150IU/L rHCG、20% SPS、2mg/L EGF和25mmol/L丙酮酸钠以1：3：2：2的比例充分混合，以此制得离子液备用；

S4、溶液混合：将步骤S1得到的血清、步骤S2得到的抗生素液和步骤S3得到的离子液以5：1：2的比例混合，并充分搅拌，以此得到营养液；

S5、PH值调试：检测步骤S4中得到的营养液的PH值，通过添加3.7%的NaHCO3和HEPES溶液进行PH值的调试，并使得混合液PH值在范围7.2-7.4内（即若PH值小于7.2，则添加NaHCO3，若PH值大于7.4，则添加HEPES溶液，直至PH值在7.2-7.4时为止），以此完成培养液的制作。

优选的，所述步骤S1中的血液为牛犊动脉血液。

优选的，所述步骤S4中充分搅拌的用时为30-40分钟。

优选的，所述步骤S5中添加的NaHCO3和HEPES溶液的总质量不得超过原营养液质量的3%。

一种人卵母细胞的培养方法，包含以下操作步骤：

S1、培养皿的准备：根据培养的规模选择容量适合的培养皿，并对所选的培养皿进行清洗和消毒操作；