[发明专利]外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法

说明书

本发明涉及一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，包括：1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；其中，所述培养基A在AIM‑V培养基的基础上额外添加了自体血浆、GM‑CSF、IL‑4以及PEG‑2；所述培养基B在AIM‑V培养基的基础上额外添加了无外泌体自体血浆、GM‑CSF、IL‑4、TGF‑β、VEGF。该方法不仅能够有效抑制DC成熟，还具有较高的外泌体收率。

技术领域

本发明涉及外泌体分离技术领域，具体而言，涉及一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法。

背景技术

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞，表面表达B7、MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1等多种共刺激分子，激活辅助T细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，传递特异性抗原信号，最终活化细胞毒性T细胞，因此DC细胞在体内起到启动一系列免疫反应的关键作用，在机体的免疫功能以及肿瘤的免疫治理中有重要意义。

大多数DC细胞来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织中，DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，但数量极少，仅占外周血单个核细胞的1％以下。DC前体细胞随血液分布到肠道、心、肝等各非淋巴器官后，发育为不成熟DC细胞。此时，DC细胞具有较强的抗原摄取加工能力，而激活T细胞的能力低下。

不成熟DC通常指的是未被外来抗原或者外界环境中的炎症因子所刺激的DC，它具有强大的胞吞功能，即通过巨胞饮吞噬水溶性的抗原，受体介导的内吞作用摄取蛋白质和抗原-抗体免疫复合物，或者直接吞唾消化整个细胞。它表面低表达MHCII，CD80，CD86等分子。

外泌体(exosomes)，是一种脂质分子膜包裹的小囊泡。电镜下观察呈杯状，直径约为40-100nm，密度约为1.13-1.19g/mL。外泌体含有来源细胞的胞质和脂质包膜成分，外泌体内部包含有丰富的mRNA，microRNA和蛋白质成分。

外泌体形成是通过多囊泡胞内体(MVE)的细胞区室向内出芽的形式形成，内囊泡内含有蛋白质、microRNA及mRNA。当MVE与细胞膜融合时，内囊泡就被释放到细胞外成为外泌体，释放出来的外泌体能够运行到距离较远的组织而影响细胞的行为和生理上的改变。

正常状态下，免疫系统维持稳态，即对自身抗原耐受，而对外来抗原启动免疫应答，以清除外来抗原。DC的成熟状态在免疫系统维持稳态的这一过程中起着非常重要的作用。成熟DC表面高表达MHC II、CD80、CD86等分子，能够刺激初始T淋巴细胞对外来抗原进行应答，进而消灭外来抗原。而不成熟DC提呈自身抗原，诱导T淋巴细胞免疫耐受，从而避免免疫系统对自身组织的攻击。因而，不成熟DC细胞的外泌体在多种自身免疫性疾病方面有广阔的应用前景，然而现有技术中缺乏一种完善的不成熟DC细胞的外泌体的制备方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，该方法制备得到的不成熟DC细胞外泌体高效、成本低、纯度高。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，包括：

1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；

2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；