[发明专利]外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法

权利要求书

1.一种外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，包括：

1)将从外周血中分离得到的PBMC细胞使用培养基A培养，得到离体不成熟树突状细胞；

2)将所述离体未成熟树突状细胞在培养基B中培养后，将培养液低温离心以去除死细胞和碎片，过滤去除囊泡；得到的液体进行超速离心，弃上清，得到不成熟DC细胞外泌体；

其中，所述培养基A为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％自体血浆、GM-CSF 40～60ng/mL、IL-4 10～30ng/mL以及PEG-2 0.4～0.6μg/mL；

所述培养基B为额外添加包括下列成分的AIM-V培养基：0.8～1.2v/v％无外泌体自体血浆、GM-CSF 30～50ng/mL、IL-4 30～50ng/mL、TGF-β10～20ng/mL、VEGF 40～50ng/mL。

2.根据权利要求1所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，在使用培养基A培养之前还包括贴壁培养，在所述贴壁培养中，PBMC细胞的接种密度为4～6×10⁷/20ml。

3.根据权利要求2所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述贴壁培养所用的培养基为包含0.8～1.2％自体血浆的AIM-V培养基。

4.根据权利要求1～3任一项所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，步骤1)的培养时间为4d～6d；

优选的，在培养的第2d～4d时，补加所述培养基A。

5.根据权利要求4所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，在将所述离体未成熟树突状细胞从培养基A转移到培养基B中时，将培养基A中的细胞收集到离心管中，离心后去上清，用培养基B重悬并转移到新培养瓶中；

优选的，所述离心的条件为1300～1500rpm离心3min～7min；

优选的，所述将培养基A中的细胞收集到离心管中的过程包括：

a).先将含有游离细胞的培养基A收集到离心管中；

b).将培养瓶中加入缓冲液，置于2℃～6℃的温度中5min～15min后拍打培养瓶，收集缓冲液；

任选的，重复步骤b)一次或多次。

6.根据权利要求1所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，在步骤2)中，培养时所用的培养瓶预先经过自体血浆包被；

优选的，所述包被的方法包括：

以瓶底培养面积为75cm²计，加入6ml～8ml自体血浆包被8h～16h。

7.根据权利要求1所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述无外泌体自体血浆通过以下方法制备得到：

血浆于110000g～130000g的转速离心8h～16h；

吸取上层澄清血清并用0.20μm～0.24μm滤膜过滤，收集滤液即得。

8.根据权利要求6或7所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，步骤2)的培养时间为36h～60h。

9.根据权利要求1所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述低温离心为2℃～6℃下以1800g～2200g离心；

优选的，所述低温离心的时间为5min～15min；

优选的，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.20μm～0.24μm。

10.根据权利要求1所述的外周血不成熟DC细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述超速离心的转速为100000g～130000g，离心时间为3h～6h。