[发明专利]用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒

说明书

本发明提供用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒。所述LAMP引物的序列如Seq ID No.1‑4所示。本发明将环介导恒温扩增技术用于桃黑星菌的快速检测，可从发病植物组织等复杂的病原菌环境准确地检测出桃黑星菌。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对桃黑星菌的各种形态的繁殖体如菌丝、孢子等进行检测，对桃黑星病疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

技术领域

本发明属于植物病原菌检测技术领域，具体地说，涉及用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒。

背景技术

由桃黑星菌(Venturia carpophila，又名嗜果黑星菌，属子囊菌亚门球壳目黑星菌属真菌)引起的疮痂病是桃产区重要的病害之一，桃疮痂病的发生严重影响了桃的品质和价值。该病在果面产生暗褐色至黑色小点，症状易与桃穿孔病、黑斑病、溃疡病及早期炭疽病混淆，基层农技推广人员及果农难以区分，常发生病害诊断错误的案例；桃黑星菌在寄主上潜伏期长，实验室纯培养时难分离、生长慢、易污染。准确识别疮痂病对科学防治该病害至关重要。

若在喷药前能够准确鉴定病原菌种类，就可以准确制定杀菌剂喷施计划，以提高防治效果，减少农药使用。目前比较常用的鉴定方法包括两种，即以发病症状为基础的传统鉴定法和基于目标基因的分子鉴定法。传统的症状识别法根据病害的发病症状进行鉴定。该方法需要从业人员具有过硬的病害识别能力和丰富的病害识别经验，但由于不同品种、不同地域、不同生长阶段病害症状不同，且疮痂病发病症状难与穿孔病、黑斑病、溃疡病、早期炭疽病症状区分，故症状识别法难以推广。同时，由于桃黑星菌难分离、生长慢、易污染等属性，分子鉴定法通常需要几周时间，工作难度及工作量大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作。而普通的PCR检测技术，所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，不适合在田间或者基层农业技术部门推广。

发明内容

本发明旨在克服现有方法检测周期长，工作量大，需要无菌条件，以及PCR技术对仪器和人员技术要求高的缺陷，提供用于检测桃黑星菌的LAMP引物及检测试剂盒，以及在此基础上建立一种基于分子水平的方便、灵敏、结果判断直观且便于基层推广使用的桃黑星菌检测方法。

本发明构思如下：对桃黑星菌进行研究发现，桃黑星菌的ITS1/ITS4引物扩增片段147～163位碱基与相近种苹果黑星菌(Venturia inaequalis)、梨黑星菌(Venturianashicola)及症状易混淆的桃黑斑病菌(Alternaria tenuissima)、桃溃疡病菌(Phomopsis amygdali)、桃炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)存在明显差异。经验证，桃黑星菌147～163位碱基区段是区别于其他病原菌的特异位点。在此基础上设计相应引物，根据扩增结果实现对桃黑星菌的检测。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于检测桃黑星菌(Venturiacarpophila)的LAMP引物，包括(SEQ ID NO:1-4)：

外侧正向引物VC-F3：5’-AGCAAGCCCTGCCTAGA-3’；

外侧反向引物VC-B3：5’-TGCCCCCCGGAATACCA-3’；以及

内侧正向引物VC-FIP(F1c+F2)：5’-TGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAGTCTGAGGAGAAAGCC-3’；

内侧反向引物VC-BIP(B1c+B2)：5’-GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGA-3’。

第二方面，本发明提供含有所述LAMP引物的用于检测桃黑星菌的试剂及试剂盒。

可选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、Thermopol Buffer、MgSO₄或MgCl₂、甜菜碱中的至少一种。