[发明专利]一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法及其应用，表达载体、表达系统及其制备方法

权利要求书

1.一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列克隆到表达载体的筛选标记基因的下游，构建真核表达载体；所述miRNAs序列为hsa-let-7f；

（2）将目的基因克隆到真核表达载体上，构建重组表达载体；

（3）将重组表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统；

（4）对CHO细胞表达系统进行诱导表达，得到目的蛋白；

所述真核表达载体为pIRES-C3-UTR载体；

将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列克隆到双顺反子表达载体pIRES-C3的筛选标记基因NEO^r的下游、polyA的上游，构建所述真核表达载体pIRES-C3-UTR载体；筛选标记基因NEO^r的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述CHO细胞为CHO-S细胞。

2.根据权利要求1所述的提高CHO细胞重组蛋白表达水平的方法，其特征在于：与hsa-let-7f序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列为如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中所示序列中的任意一种。

3.一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的真核表达载体，其特征在于：所述真核表达载体为pIRES-C3-UTR载体；

将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列克隆到双顺反子表达载体pIRES-C3的筛选标记基因NEO^r的下游、polyA的上游，构建所述真核表达载体pIRES-C3-UTR载体；筛选标记基因NEO^r的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述miRNAs序列为hsa-let-7f。

4.一种提高CHO细胞重组蛋白表达水平的重组表达载体，其特征在于：将目的基因克隆到真核表达载体上，构建重组表达载体；所述真核表达载体为pIRES-C3-UTR载体；

将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列克隆到双顺反子表达载体pIRES-C3的筛选标记基因NEO^r的下游、polyA的上游，构建所述真核表达载体pIRES-C3-UTR载体；筛选标记基因NEO^r的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述miRNAs序列为hsa-let-7f；

所述CHO细胞为CHO-S细胞。

5.如权利要求4所述的提高CHO细胞重组蛋白表达水平的重组表达载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将与CHO细胞内源miRNAs序列互补结合的mRNA靶基因的3′-UTR转录区序列克隆到表达载体的筛选标记基因的下游，构建真核表达载体；将目的基因克隆到真核表达载体上，构建重组表达载体。

6.一种CHO细胞表达系统，其特征在于：所述CHO细胞表达系统中转染有如权利要求4所述的重组表达载体，所述CHO细胞为CHO-S细胞。

7.如权利要求6所述的CHO细胞表达系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将重组表达载体转染到CHO细胞中，培养并筛选，得到CHO细胞表达系统。