[发明专利]筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株的方法

说明书

本发明提供了一种筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株的方法，包括以下步骤：步骤一，经诱变后的菌悬液稀释适当倍数后涂布于高氏一号固体培养基上培养四天，培养基表面有明显单菌落生成；步骤二，将培养基上的单菌落编号标记，用无菌牙签挑取少量菌落上的菌体对应转移至新培养基上培养，为验证后的高产菌株保存孢子；步骤三，使用灭菌后的醋酸纤维素膜覆盖于高氏一号培养基表面，轻轻挤压使单菌落上菌体粘附于膜表面，粘附菌体一面向上转移至发酵固体培养基上继续培养7‑10天，至形成较大的单菌落，表面有明显的白色孢子。本发明提高谷氨酰胺转氨酶高产菌株的筛选效率，缩短筛选周期，减少成本，提高实验结果准确性。

技术领域

本发明涉及一种筛选方法，具体地，涉及一种筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株的方法。

背景技术

现有谷氨酰胺转氨酶高产菌株的筛选方法多为孔板筛选，存在以下问题：

一，孔板筛选的工作量大，成本高。

二，周期长，筛选效率低。

三，孔板生长环境要求严格，出现菌株结团现象，对菌株生长和酶的产生影响大。

四，酶活测定偏差大，增加实验结果误差。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明要解决的技术问题是提供一种筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株的方法，其提高谷氨酰胺转氨酶高产菌株的筛选效率，缩短筛选周期，减少成本，提高实验结果准确性。

根据本发明的一个方面，提供一种筛选谷氨酰胺转氨酶高产菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，经诱变后的菌悬液稀释适当倍数后涂布于高氏一号固体培养基上培养四天，培养基表面有明显单菌落生成；

步骤二，将培养基上的单菌落编号标记，用无菌牙签挑取少量菌落上的菌体对应转移至新培养基上培养，为验证后的高产菌株保存孢子；

步骤三，使用灭菌后的醋酸纤维素膜覆盖于高氏一号培养基表面，轻轻挤压使单菌落上菌体粘附于膜表面，粘附菌体一面向上转移至发酵固体培养基上继续培养7-10天，至形成较大的单菌落，表面有明显的白色孢子；

步骤四，取下长有单菌落的醋酸纤维素膜置于滤纸上，均匀喷洒底物溶液后迅速将膜转移至37℃下反应十分钟，取出后继续均匀喷洒一定量的终止剂至菌落上形成明显的红色；

步骤五，选取颜色较深的菌株，扩培对应的孢子后进行复筛；

步骤六，保存孢子后传代验证其遗传稳定性，八代遗传后若酶活稳定即为筛选的目的菌株。

优选地，所述步骤五包括以下具体步骤：50 mL离心管中添加5 mL种子培养基，接种后培养二十四小时转接发酵培养基，发酵培养30小时后测算酶活；将其中酶活较高菌株进行摇瓶验证，种子培养时间为36小时，发酵培养基培养时间为48小时，选取其中高产菌株。

优选地，所述测算酶活包括如下步骤：取发酵上清液60uL于1.5mL管中，加150uL试剂底物溶液，在37℃下保温10min后加入60uL终止剂终止反应；525nm波长下测定吸光值，根据测定的标准曲线计算酶活。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提高谷氨酰胺转氨酶高产菌株的筛选效率，缩短筛选周期，减少成本，提高实验结果准确性。本发明中醋酸纤维素膜具有很好的过滤杂菌，吸附性小等优点，在筛选过程中起到很好的转移载体的作用。且该膜上流动性较弱，液体不易扩散，减少菌株之间的干扰。本发明改变了以往的定量测定酶活的固定方法，在初筛时直接通过比较颜色的深浅选取需要复筛的高产菌株，节约时间和成本。本发明不再使用孔板培养菌体，直接在固体培养基上进行培养，待单菌落产出孢子后，菌体表面即有酶分泌，通过喷洒底物和终止剂即可判断高产菌株，大大降低工作量。

具体实施方式