[发明专利]用于下一代测序仪的引物及其制备方法，通过使用用于下一代测序仪的引物得到的DNA文库及其制备方法，以及使用DNA文库的DNA分析方法

说明书

本发明提供了用于下一代测序仪的引物，其可以提供大数量的读段。基于序列：5'‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT‑N_5至15‑GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG‑3'(其中N_5至15表示5至15个核苷酸的索引序列)，将索引序列设计为表现出推定读段数量超过给定水平的核苷酸序列，其中该推定读段数量根据将读段数量指定为目的变量并将索引序列中的核苷酸类型指定为解释变量的估算公式计算得出。

技术领域

本发明涉及用于下一代测序仪的具有索引的能够同时分析多种分析物的引物，其制备方法，使用用于下一代测序仪的引物的DNA文库，其制备方法，以及使用DNA文库分析基因组DNA方法。

发明背景

下一代测序仪(NGS)是一种可以并行读取许多DNA片段的核苷酸序列的设备。例如，对于下一代测序仪(Illumina)的使用，将接头(adaptor)连接到随机切割的数千万至数亿个DNA片段的两端，其5'末端经由接头固定于流通池上。随后，将预先固定在流通池上的5'末端接头与DNA片段的3'末端接头序列退火，以形成桥式DNA片段。在该状态下借助于DNA聚合酶进行核酸扩增反应，从而可以局部扩增和固定许多单链DNA片段。下一代测序仪使用所得的单链DNA作为模板进行测序。因此，通过一次分析可以获得多达40到200Gb的序列信息。

使用下一代测序仪的测序是通过在荧光显微镜下分析荧光标记dNTP摄取的方法进行的。具体地，使用被保护基团封闭并且在3'末端被荧光标记的dNTP。在DNA聚合酶的帮助下将与单链DNA片段互补的dNTP掺入，用激光束激发dNTP，并在荧光显微镜下读取荧光。从dNTP去除保护基团，然后以相同方式分析后面的核苷酸。这样，下一代测序仪连续地分析固定在流通池上的单链DNA的每个核苷酸。

特别地，根据下一代测序仪，将索引(也称为“索引序列”或“条形码序列”)提供给与DNA分析物片段连接的接头，从而使源自多个样本的DNA片段可以彼此区分。如上所描述，具体地，经由一次分析可以获得巨量的序列信息，并且可以使用序列信息中包含的索引序列作为指示物来鉴定与目的DNA片段有关的序列信息所来自的样品的来源。

然而，如非专利文献1中所述，使用索引序列通过下一代测序仪进行的分析具有劣势，读段数量根据索引序列有显著差异而言。然而，在非专利文献1中，不利的是，没有系统地分析与索引序列的性质相关的差异，并且使用索引序列的下一代测序仪的分析的准确度不足。

之前已知一种方法，其中将包含不同核苷酸序列的通用尾序列分别添加到一对引物的每一条中，然后使用该对引物进行多重PCR，获得一组扩增子(即，具有相同索引序列的扩增子)应用于下一代测序仪(专利文献1)。此外，为了改进大量样品的分析效率，已知一种方法，使用引物对制备用于下一代测序仪的DNA文库，其中每个引物分别包含接头，索引和靶DNA特异性序列(专利文献2)。专利文献2中公开的引物是由特异性结合靶DNA如人线粒体DNA高变区的引物、产生NGS文库所必需的接头引物、索引引物和测序引物组成的集成引物(integrated primer)。

引用列表

非专利文献

NPL 1：David W.Craig等，Nat.Methods，2008年10月；5(10)：887-893

专利文献

PTL 1：US 2016/0326572 A1

PTL 2：JP 2017-97935 A

发明概述

技术问题