[发明专利]具有改变的PAM特异性的工程化的CRISPR-Cas9核酸酶

说明书

具有改变的和改进的PAM特异性的工程化的CRISPR‑Cas9核酸酶及其在基因组工程、表观基因组工程、和基因组靶向中的应用。

优先权声明

本申请要求2017年8月23日提交的美国临时专利申请系列号No.62/549,303的权益；以及2018年3月12日提交的美国临时专利申请系列号No.62/641,687的权益。上述的全部内容通过引用并入本文。

联邦政府赞助的研究或开发

本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号No.GM105378、GM107427、GM118158和GM088040的政府资助下完成的。政府在本发明中享有一定的权利。

技术领域

本发明至少部分涉及工程化的成簇规律间隔的短回文重复(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)核酸酶，其具有改变和改进的前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)特异性及其在基因组工程、表观基因组工程和基因组靶向中的用途。

背景技术

CRISPR-Cas9核酸酶能够在多种生物体和细胞类型中实现有效的、可定制的基因组编辑(SanderJoung,Nat Biotechnol 32,347-355(2014)；Hsuet等人,Cell 157,1262-1278(2014)；DoudnaCharpentier,Science 346,1258096(2014)；BarrangouMay,ExpertOpin Biol Ther 15,311-314(2015))。Cas9的靶位点识别由两个称为crRNA和tracrRNA的短RNA指导(Deltcheva等人,Nature 471,602-607(2011)；Jinek等人,Science 337,816-821(2012))，可以将其融合至嵌合单指导RNA(sgRNA)中(Jinek等人,Science 337,816-821(2012)；Jinek等人,Elife 2,e00471(2013)；Mali等人,Science 339,823-826(2013)；Cong等人,Science 339,819-823(2013))。sgRNA的5'端(源自crRNA)可以与靶DNA位点碱基配对，从而可以通过Cas9/sgRNA复合物直接对位点特异性切割进行重新编程(Jinek等人,Science 337,816-821(2012))。但是，Cas9还必须识别与sgRNA碱基配对的DNA邻近的特定前间区序列邻近基序(PAM)(Mojica等人,Microbiology 155,733-740(2009)；Shah等人,RNA Biol 10,891-899(2013)；Jinek等人,Science 337,816-821(2012)；Sapranauskas等人,Nucleic Acids Res 39,9275-9282(2011)；Horvath等人,J Bacteriol 190,1401-1412(2008))，这是启动序列特异性识别所必需的要求(Sternberg等人,Nature 507,62-67(2014))，但也可以限制用于基因组编辑的这些核酸酶的靶向范围。广泛使用的化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)识别短的NGG PAM(Jinek等人,Science 337,816-821(2012)；Jiang等人,Nat Biotechnol 31,233-239(2013))，在随机DNA序列中每8bp发生一次。相比之下，迄今已表征的其他Cas9直系同源物可以识别更长的PAM(Horvath等人,J Bacteriol 190,1401-1412(2008)；Fonfara等人,Nucleic Acids Res 42,2577-2590(2014)；Esvelt等人,Nat Methods 10,1116-1121(2013)；Ran等人,Nature 520,186-191(2015)；Zhang等人,Mol Cell 50,488-503(2013))。例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)是几种更适合病毒递送的较小Cas9直系同源物之一(Horvath等人,J Bacteriol 190,1401-1412(2008)；Ran等人,Nature 520,186-191(2015)；Zhang等人,Mol Cell 50,488-503(2013))，识别更长的NNGRRT PAM，预期在随机DNA中每32bp发生一次。扩大Cas9直系同源物的靶向范围对于包括修饰小遗传元件(例如转录因子结合位点(Canver等人Nature.527(7577):192-7(2015)；Vierstra等人,NatMethods.12(10):927-30(2015))或通过在PAM中定位序列差异进行等位基因特异性改变(Courtney,D.G.等人Gene Ther.23(1):108-12(2015))等各种应用是重要的。我们先前工程化了可以识别具有NGA和NGCG PAM序列的位点的SpCas9变体(Kleinstiver等人,Nature2015；WO 2016141224)，但是许多替代的PAM序列仍然是不可靶向的。