[发明专利]具有改变的PAM特异性的工程化的CRISPR-Cas9核酸酶

权利要求书

1.一种分离的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)蛋白，其在以下三个、四个、五个或全部六个位置具有突变：D1135、S1136、G1218、E1219、R1335和/或T1337，其中所述突变不是VSREER或VSREQR。

2.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％相同的序列。

3.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其包含表A、1、2或3中所示的突变的组。

4.根据权利要求1-3任一项所述的分离的蛋白，其包含以下突变的组：LRSVQL、LRKIQK、LRSVQK、LWKIQK、VRKIQK、LWKIQK、IRAVQL、VRKLRS、GRKIQK、SWRVVV、SWKVLK、TAHFKV、MSGVKC、LRSVRS、SKTLRP、MWVHLN、TWSMRG、KRRCKV、VRAVQL、VSSVRS、VRSVRS、SRMHCK、GWKLLR、GWKOQK、VAKLLR、VAKIQK、VAKILR、GRKILR、VRKLLR、IRAVQL、VRKIQK或VRMHCK变体(例如，对于NGTNPAM)；MQKSER、VRKSER、ICKSER、LRSVER、LWLETR、LSRWER、MQSVQL、VRREER、ICCCER、LSRWQR、LWRVVA、WMQAYG、LWRSEY、SQSWRS、LKAWRS、LWGWQH、MCSFER、LWMREQ、LWRVVA、HSSWVR、MWSEPT、GSNYQS、FMQWVN、YCSWVG、MCAWCG、FMQWVR或SSKWPA变体(例如，对于NGCN PAM)；LRSVRS、SRQMRG、MRARKE、SRMHCK、VRREQR、VRGEQR、LRLSAR、AWTEVTR、KWMMCG、VRGAKE、AWNFQV、LWTTLN、SRMHCK、CWCQCV、AEEQQR、GWEKVR、NRAVNG、LRSYLH、VRGNNR、VQDAQR、GWRQSK、AWLCLS、KWARVV、MWAARP、SRMHCK、VKMAKG、QRKTRE、LCRQQR、CWSHQR、SRTHTQ、LWEVIR、VSSVRS、VRSVRS、IRAVRS、SRSVRS、LWKIQK或VRMHCK变体(例如，对于NGAN PAM)。

5.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其进一步包含一种或多种降低核酸酶活性的突变，所述突变选自由在D10、E762、D839、H983、或D986处；和在H840或N863处的突变组成的组。

6.根据权利要求5所述的分离的蛋白，其中所述突变是：

(i)D10A或D10N，和

(ii)H840A、H840N或H840Y。

7.根据权利要求1所述的分离的蛋白，其进一步包含一种或多种增加特异性的突变，所述突变选自由在N497、R661、N692、M694、Q695、H698、K810、K848、Q926、K1003和R0160处，和任选地在K526和/或R691处的突变组成的组。