[发明专利]单分子肽测序的手段和方法

说明书

本发明涉及生物化学领域，更特别地涉及蛋白质组学，更特别地涉及蛋白质测序，甚至更特别地涉及单分子肽测序。本发明公开了使用裂解诱导剂进行单分子蛋白质测序和/或氨基酸鉴定的手段和方法。所述裂解诱导剂不是对一种特定氨基酸是特异性的，其从N末端开始逐步裂解多肽，并基于所述反应的动力学来提供关于裂解的氨基酸的身份的信息。

发明领域

本发明涉及生物化学领域，更特别地涉及蛋白质组学，更特别地涉及蛋白质测序，甚至更特别地涉及单分子肽测序。本发明公开了使用裂解诱导剂进行单分子蛋白质测序和/或氨基酸鉴定的手段和方法。所述不是对一种特定氨基酸特异性的裂解诱导剂，从N末端开始逐步裂解多肽，并基于所述裂解诱导剂与多肽之间的啮合(engagement)动力学或所述多肽裂解反应的动力学来提供关于裂解的氨基酸的身份的信息。

背景

生物分子(DNA、RNA、蛋白质)的高通量测序技术正在迅速发展，并且对于现代科学和医学至关重要。尤其是DNA测序技术已经取得了巨大飞跃，目前已从二代技术发展到作用于单分子水平的第三代方法(例如Pacific Biosciences，Oxford Nanopores；Ambardar等，2016Indian J Microbiol 56：394-404)。DNA的均匀性质和广泛的可用分子工具组确实推动了该领域的发展。相比之下，蛋白质/肽的测序相对滞后，并且很大程度上依赖于基于液相色谱-质谱(LC-MS)的技术。尽管LC-MS仪器在速度、灵敏度和分辨率方面已取得了很大进步，但操作和维护机器却非常复杂且昂贵。此外，基于MS的蛋白质组学仍然需要大约10⁶个拷贝的蛋白质/肽才能被检测到。目前无法进行单蛋白质/肽测序，因此无法实现如单细胞蛋白质组学这样的应用。此外，由于蛋白质无法像DNA一样进行扩增，因此单分子测序从概念上讲是更好的选择，而且可以进一步对蛋白质进行数字量化。

下一代蛋白质测序的概念正在萌芽，但面临重大挑战。首先，要区分二十种氨基酸(相比之下，只有四种核苷酸)，并且获得单个可测量参数以严格识别每种氨基酸似乎不太可能。然而，甚至通过概率方式能够将某个氨基酸类别归因于每个序列位置，对于通过基于约束的肽识别从数据库进行剖析(如针对LC-MS数据所做的那样)，可能就已经足够了(Swaminathan等。2015PLoS Comput Biol.11：e1004080)。其次，就理化性质而言，蛋白质极不均一。通过应用自下而上的蛋白质组学方法，即通过蛋白酶介导的蛋白质组消化成肽，可以在一定程度上减少这种情况。动态范围为几个数量级的这种复杂的肽混合物的并行测序将不可避免地面临巨大的技术障碍。通过从肽库中纯化(蛋白型)肽的子集，可以进一步降低复杂性。通过(固态)纳米孔的肽测序是目前研究中最受欢迎的平台。对纳米孔的工程化进行了广泛的研究，这些工程化能够转运肽并沿序列区分氨基酸或氨基酸类别(Kennedy等2016Nat Nanotechnol 11：968-976；Wilson等2016Adv Funct Mater 26：4830-4838)。

Mitra等(WO 2010/065531)开发了另一种有希望的以灵敏和定量的方式分析蛋白质的技术。这项技术被称为通过末端测序的蛋白质数字分析或DAPES，其特征是一种用于单分子蛋白质分析的方法。为了进行DAPES，将大量蛋白质变性并裂解成肽。将这些肽固定在应用于显微镜载玻片表面的纳米凝胶表面上，并使用涉及Edman降解的方法并行测定其氨基酸序列。将异硫氰酸苯酯(PITC)添加到载玻片中，并与每种肽的N端氨基酸反应形成稳定的苯硫脲衍生物。接着，通过例如用每个PITC衍生的N末端氨基酸特异性的抗体进行20轮抗体结合、检测和剥离来确定N末端氨基酸衍生物的身份。通过升高温度或降低pH值来去除N末端氨基酸，并重复该循环以从载玻片上的每个肽中测序12-20个氨基酸。然后可以根据观察到的不同肽序列的数量来计算原始样品中每种蛋白质的绝对浓度。DAPES中使用的PITC化学性质与Edman降解中使用的相同，并且高效且耐用(效率99％)。然而，单个氨基酸的裂解需要强的无水酸，或替换地，高温水性缓冲液。对于用于单分子蛋白质检测(SMD)的敏感底物上的多轮分析，不希望在这些严酷条件中的任一个之间进行循环。