[发明专利]短核酸的多重检测

说明书

本文提供了用于进行多重RT‑PCR以扩增短核酸的方法和组合物。

发明背景

受到样品收集的简单和成本降低的激励，非侵入性样品收集(例如，血液、血浆、唾液、尿液)正变得更常见。液体活检样品中的核酸生物标志物通常是短的，例如长度小于250个核苷酸。液体活检样品中的疾病相关的生物标志物的实例是miRNA分子，其中几种已经在各种疾病状态下以异常水平被发现。miRNA分子长度通常为16-30个核苷酸。

生物标志物核酸通常在液体活检样品中相当罕见，因此所述生物标志物核酸的扩增有利于增加检测的灵敏度。然而，短核酸序列的特异性扩增是有挑战性的。扩增引物经常在15-25个核苷酸的范围内，且较短的互补序列可以导致特异性降低。因此，尽管扩增和检测技术通常需要两个引物和一个探针，但这些要素各自可以与液体活检样品中的靶向核酸大小约相同。

一种扩增和检测短核酸序列的方法公开于WO2016027162中。该文献公开了使用双尾逆转录(RT)引物的，miRNA和其他短核酸的RT-qPCR检测。先前公开的双尾引物被设计用于每个RT和PCR孔检测一个miRNA，并使用靶标特异性正向和反向PCR引物。

对于许多诊断应用，期望监测多于一种生物标志物的水平以及每种样品的外部和/或内部对照。本公开提供了用于特异性多重扩增和检测短核酸的新型组合物和方法。

发明概述

本文提供了用于多重检测短核酸的引物、试剂盒、测定法和方法。

在一些实施方案中，提供了反应混合物，所述反应混合物包含：

a) 第一双尾引物，其从5'至3'包含：

i)与第一靶标核酸的5'末端互补的序列；

ii)第一臂序列；

iii)第一茎序列；

iv)环序列；

v)与所述第一茎序列互补的第二茎序列；

vi)第二臂序列；和

vii)与所述第一靶标核酸的3'末端互补的序列；

b) 第二双尾引物，其从5'至3'包含：

i)与第二靶标核酸的5'末端互补的序列；

ii)所述第一臂序列；

iii)所述第一茎序列；

iv)所述环序列；

v)与所述第一茎序列互补的第二茎序列；

vi)所述第二臂序列；和

vii)与所述第二靶标核酸的3'末端互补的序列；

c) 与所述第一靶标核酸的逆转录产物互补的第一靶标特异性反向PCR引物；

d) 与所述第二靶标核酸的逆转录产物互补的第二靶标特异性反向PCR引物；

e) 与所述第一臂序列、第一茎序列和/或环序列互补的通用正向PCR引物；

f) 第一可检测标记的探针，其从5'至3'包含：

i)与所述第二茎序列和/或所述第二臂序列互补的序列；和

ii)与以下互补的序列：与所述第一靶标核酸的3'末端互补的序列；和

iii)与所述第一靶标核酸的逆转录产物互补的序列；和

g) 第二可检测标记的探针，其从5'至3'包含：

i)与所述第二茎序列和/或所述第二臂序列互补的序列；和