[发明专利]用于去除和/或检测具有错配的核苷酸的核酸的方法

权利要求书

1.用于切割在连接反应中产生的衔接子二聚体的方法，包括：

(a)将加T尾的双链衔接子与核酸的加A尾的双链片段连接，以产生包含以下的连接产物：(i)衔接子连接的双链核酸片段和(ii)在连接接点处包含T:T错配的双链衔接子二聚体；

(b)使用EndoMS切割所述衔接子二聚体的两条链。

2.权利要求1所述的方法，进一步包括(c)扩增所述衔接子连接的双链核酸片段。

3.权利要求2所述的方法，其中所述扩增是使用与所述连接的衔接子杂交的引物或其互补序列来完成的。

4.权利要求2或3所述的方法，其中所述方法是在不按尺寸富集所述衔接子连接的双链核酸片段的情况下进行的。

5.任一前述权利要求所述的方法，其中所述双链核酸片段是基因组片段。

6.任一前述权利要求所述的方法，其中所述加T尾的双链衔接子是Y衔接子或一对Y衔接子。

7.任一前述权利要求所述的方法，其中所述加T尾的双链衔接子是环衔接子。

8.任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括温育包含所述加T尾的双链衔接子、核酸的所述加A尾的双链片段、连接酶和所述EndoMS的反应混合物，以产生所述连接产物，和切割所述衔接子二聚体的两条链。

9.任一前述权利要求所述的方法，其中所述EndoMS是热稳定的。

10.试剂盒，其包括：

(a)加T尾的双链衔接子；和

(b)EndoMS酶。

11.权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含连接酶。

12.权利要求10-11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含反应缓冲液。

13.方法，包括：

(a)使第一单链核酸和与所述第一核酸中的靶序列不完全互补的第二单链核酸杂交，以产生包含一个或多个错配的双链体核酸；和

(b)用EndoMS处理所述双链体核酸，以在所述靶序列处切割所述双链体核酸。

14.权利要求13所述的方法，其中所述第二单链核酸是寡核苷酸。

15.权利要求13或14所述的方法，其中所述第一单链核酸是变性的dsDNA。

16.权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述杂交通过链侵入进行。

17.权利要求13-16中任一项所述的方法，其中在所述双链体中，第一核酸和第二核酸在错配的每一侧都包含至少8个完全互补的核苷酸。

18.识别双链核酸中错配的核苷酸的方法，包括：

(a)使包含所述双链核酸的样品与EndoMS反应，以产生反应产物，其中所述EndoMS仅在所述双链核酸包含错配的情况下切割所述双链核酸的两条链；

(b)如果所述双链核酸未被切割而不是其被切割，则在使所述双链核酸扩增的条件下，使(a)的所述反应产物进行扩增；和

(c)检测扩增产物的存在，其中所述产物的存在指示所述双链核酸不具有错配的核苷酸，而产物的不存在指示所述双链核酸具有错配的核苷酸。

19.权利要求17所述的方法，其中步骤(b)是使用在所述错配侧翼的引物，通过PCR进行的。

20.权利要求18-19中任一项所述的方法，其中错配在连接接点处。