[发明专利]用于裂解红细胞的组合物和方法

说明书

本公开内容提供了用于从全血裂解红细胞的方法和试剂盒。

相关专利申请

本申请要求于2017年5月8日提交的美国临时专利申请No.62/503,202的权益。出于所有目的，将该临时专利申请的全部内容整体并入本文。

技术领域

本发明涉及用于裂解红细胞的方法和组合物。

背景技术

在内源性全血样品中，红细胞(red blood cell，RBC)与白细胞(white bloodcell，WBC)以1000∶1的比例存在，这使得WBC群体在全血中为小概率事件(rare event)。为了通过流式细胞术正确地分析全血样品中的WBC，首先需要去除RBC以浓缩WBC群体并从采集中提供有意义的数据。

目前的RBC裂解方法涉及低渗、盐、pH变化、洗涤剂以及甚至RBC酶促活性的改变以诱导内部pH和体积的变化，所述方法具有严重的缺点。基于低渗的裂解方法经常产生不一致的结果，并且可导致一些WBC群体(主要是粒细胞)的破裂。因此，该方法经常诱导细胞活化状态的改变，并导致WBC群体的光散射谱的改变。基于盐的裂解(例如基于NH₄Cl的裂解)是缓慢的并且可受到血清成分的极大影响。这些方法经常需要非常大的体积和延长的孵育时间来实现完全裂解，这可导致细胞死亡增加。此外，基于盐的裂解经常伴随着快速的pH变化，这可损害细胞表位和WBC。基于洗涤剂的裂解经常对老化的样品无效。洗涤剂价格昂贵并且批次间的变化范围也很广泛。事实上，非常少的洗涤剂可裂解RBC而不同样裂解WBC(例如一些皂苷)。依赖于红细胞代谢的裂解方法具有供体间的变异性并且也可对老化的试样无效。

此外，这些目前的方法中的许多经常需要多种专用的缓冲液，并因此难以用于基于血液的样品的工作流自动化中。所用的缓冲液的溶液黏度的差异可损害仪器准确测量分配体积或细胞计数的能力。这些方法经常使用大体积的缓冲液，并因此也可要求在裂解之后将样品离心以减少样品体积。

发明概述

本发明使得能够在等渗、中性pH的条件下快速裂解全血样品中的RBC。本公开内容提供了裂解红细胞的方法，其包括：使包含红细胞和白细胞的样品与包含固定剂的第一缓冲液接触以形成第一混合物，第一缓冲液的溶质浓度大于样品的溶质浓度；以及向由样品和第一缓冲液形成的第一混合物添加第二缓冲液以形成第二混合物，其中第二混合物中的溶质浓度与样品的溶质浓度基本上相同，并由此裂解样品中的红细胞。

在一些实施方案中，样品是全血样品。

在一些实施方案中，所述方法还包括在添加第二缓冲液之前，添加钙螯合剂以通过螯合钙来阻断红细胞中的钙依赖性转运。在一些实施方案中，第一缓冲液还包含钙螯合剂。

在一些实施方案中，接触步骤还包括将第一混合物孵育约0.5分钟至约20分钟的时间段。在一些实施方案中，所述方法还包括将第二混合物孵育约0.5分钟至约20分钟的第二时间段。在一些实施方案中，第二缓冲液包含约0×至约1×PBS，例如约0.9×至1×PBS。

在一些实施方案中，第一混合物包含：约0.5％至3％的甲醛，例如1.6％的甲醛；0.5mM至20mM的EDTA，例如5mM的EDTA；和1.2×至1.8×PBS，例如1.5×的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)。在一些实施方案中，第一缓冲液在约pH 7.4下包含约3.2％的甲醛、约10mM的EDTA和约323mM的盐。在一些实施方案中，第一缓冲液包含约2×PBS。在一些实施方案中，接触步骤包括将第一缓冲液与样品以1∶1的体积比混合。

本公开内容中还提供了处理全血样品的方法，其包括：形成基本上由全血样品、固定剂、高渗缓冲液和钙螯合剂组成的第一混合物，其中高渗盐水的溶质浓度大于全血的溶质浓度；以及向第一混合物添加第二缓冲液以形成等渗的第二混合物。