[发明专利]一种制备高纯度NAD的方法

说明书

一种制备高纯度NAD的方法，包括：调pH值至6.0～8.0，除去不溶物，升温至35±1℃，并加入乙醇，降温至6±0.5℃，结晶，过滤，将滤液升温至25～30℃，调pH值至1.5～3.0，加入NAD晶种，降温至12±0.5℃，结晶，待结晶率达到40%时，再加入乙醇，降温至3±0.5℃，结晶，待结晶率在90%以上时，过滤，滤饼经干燥后即得高纯度NAD产品。

技术领域

本发明涉及核苷酸类辅酶的纯化的技术领域，特别涉及对NAD的粗品溶液进行纯化的方法。

背景技术

NAD是氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)的英文缩写形式，是存在于包括人类细胞在内的所有活细胞中的一种生理物质，对身体无副作用，这种物质是很多可催化氧化—还原反应的酶的辅助因子，因此被称为辅酶Ⅰ。

NAD在生物体内参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，是线粒体中能量产生链中的控制标志物，对机体免疫能力有重要作用。如今，NAD被广泛应用于化工催化反应、原料药生产、保健品生产、以及化妆品等行业，而随着对NAD在疾病的治疗和预防方面的深入研究，NAD作为医药保健品的重要性日益凸显出来，市场需求量逐年增加。

目前，NAD的制备方法主要分为化学合成法和生物催化法，其中的生物催化法又包括生物发酵法和酶催化法，因其相较于化学合成法具有绿色环保无公害的优点而逐渐成为主流方向。通过生物催化法制备NAD得到的粗产物溶液(酶反应液或者生物发酵液)中除NAD外还含有大量杂质，NAD的纯度只有20-40％，故还需经过进一步的分离纯化处理才能得到较为纯净的NAD产品。

中国发明专利CN105131065B一种氧化型辅酶I的制备方法以及中国发明专利CN105481923B一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法中均公开了一种NAD的分离纯化方法，其中都是主要采用树脂柱进行分离和纯化。这种利用树脂柱进行分离纯化的方法操作繁琐、耗时长且溶剂使用量大，不利于大工业化生产，其后期还需对树脂进行活化处理，会用到大量的酸、碱、盐等溶剂，环境污染较大且成本较高。

发明内容

本发明的目的在于解决现有的对NAD进行分离纯化的方法所存在的操作繁琐、耗时长、成本高、污染大的技术问题，提供一种操作简单快捷、成本低廉、污染小的制备高纯度NAD的方法，用于对NAD的粗品溶液进行纯化处理。

为实现上述目的，本发明提供了一种制备高纯度NAD的方法，包括：1)将NAD的粗品溶液的pH值调节至6.0～8.0，然后除去不溶物；2)升温至35±1℃，并加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为20％～40％体积分数，搅拌至澄清；3)降温至6±0.5℃，保持pH值为6.0～8.0进行结晶，待晶体析出后进行过滤，收集滤液；4)将步骤3)的滤液升温至25～30℃，然后调节pH值至1.5～3.0，并搅拌至澄清；5)加入NAD晶种，然后降温至12±0.5℃，保持pH值为1.5～3.0，待溶液中NAD的结晶率达到40％时，再加入乙醇至溶液中乙醇的终浓度为10％～30％体积分数，混合均匀；6)降温至3±0.5℃，保持pH值为1.5～3.0进行结晶，待溶液中NAD的结晶率在90％以上时，过滤，收集滤饼，经干燥后即得高纯度NAD产品。

本发明方法中，步骤1)的NAD的粗品溶液是指除了含有NAD之外还含有大量杂质的溶液，如：将从市场中购买的纯度不够高的NAD产品溶解于水后得到的溶液，或者生物催化法制备NAD得到的粗产物溶液。

优选地，控制NAD的粗品溶液的浓度为100～300mmol/L，以确保后期能够析出足够多的晶体，从而保证足够高的收率。