[发明专利]一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体、其应用及其制备莱鲍迪苷D的方法

说明书

提供了一种UDP‑葡萄糖基转移酶突变体、其应用及制备莱鲍迪苷D的方法，对野生型UDP‑葡萄糖基转移酶的基因序列进行定点突变，获得了包括SEQ ID NO：3在内的一系列突变体，这些突变体的酶活力和pH稳定性较野生型亲本得到提高。

技术领域

本发明涉及生物酶技术领域，特别涉及一种通过基因定点突变的方法人工获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体及其用于催化制备莱鲍迪苷D的方法。

背景技术

葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶，该酶的作用机理是催化糖基供体的葡萄糖残基转移到糖基受体分子上，从而调节受体分子的活性。UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，简称UGT)是葡萄糖基转移酶中的一种，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，几乎存在于所有有机体中。

UDP-葡萄糖是二磷酸尿苷葡糖(uridine diphosphate glucose)的简称，又简称为UDP-葡糖或者UDPG，是由尿苷二磷酸和葡萄糖组成的维生素，可看作“活性葡萄糖”，广泛分布于植物、动物和微生物的细胞内，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，是最常见的一种糖基供体。

如今，随着天然甜味剂甜菊糖苷的广泛应用，以及生物催化技术的日益发展，UDP-葡萄糖基转移酶被越来越多地应用在甜菊糖苷的生物催化制备的领域中来。UDP-葡萄糖基转移酶的种类很多，目前甜菊糖苷的生物酶法制备领域中使用的酶多为来源于植物细胞中的野生酶，这种野生酶往往存在酶活低、稳定性差等缺点，从而导致应用于工业化大生产制备甜菊糖苷的成本较高。因此，有必要对UDP-葡萄糖基转移酶的野生酶进行改造，从而获得酶活更高、稳定性更好的改造酶，以便更好地服务于工业化大生产。

发明内容

本发明的目的在于解决野生型UDP-葡萄糖基转移酶酶活力低、稳定性差的技术问题，开发一种酶活力及稳定性更高的UDP-葡萄糖基转移酶。

为实现上述目的，本发明提供了一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体，该突变体为如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；

(b)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)限定的蛋白质的氨基酸序列具有90％以上同源性并且具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的蛋白质。

优选地，与如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体在至少一个如下位点处有突变：第69位、第148位、第244位、第251位、第252位、第255位、第368位、第426位和第432位。

更优选地，与如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体具有至少一个如下突变：A69D、M148L、F244P、L251S、H252P、R255G、M368L、S426R、K432N。

更优选地，与如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的突变为A69D、M148L、F244P、R255G、M368L、S426R、K432N或L251S/H252P。

同时，本发明还提供了一种生物材料，包括重组载体、重组细胞或者重组微生物，该生物材料含有编码本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的基因序列，在合适的条件下，该生物材料能够表达分泌出本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体。