[发明专利]难以表达的蛋白质的多位点特异性整合细胞

说明书

本公开涉及包含至少两种不同的重组靶位点(RTS)的位点特异性整合(SSI)哺乳动物细胞，其中两种RTS在染色体上整合于NL1基因座或NL2基因座内。该公开还涉及包含至少4种不同的RTS的SSI哺乳动物细胞，其中2种RTS在染色体上整合于NL1或NL2基因座内，而2种RTS在染色体上整合于单独的基因座内。该公开还涉及用于使用SSI哺乳动物细胞以产生可以表达难以表达的蛋白质的重组蛋白表达细胞系的方法。

发明领域

本公开涉及包含至少两种不同的重组靶位点(RTS)的位点特异性整合(SSI)哺乳动物细胞，其中两种RTS在染色体上整合于NL1基因座或NL2基因座内。该公开还涉及包含至少4种不同的RTS的SSI哺乳动物细胞，其中2种RTS在染色体上整合于NL1或NL2基因座内，而2种RTS在染色体上整合于单独的基因座内。该公开还涉及用于使用SSI哺乳动物宿主细胞系以产生可以额外表达难以表达的蛋白质的重组蛋白表达细胞系的方法。

背景技术

新型和生物仿制药生物制药持续可见高需求以及增加的销售收入。普遍性增强的新型形式、非单克隆抗体(mAb)，重组蛋白(rP)中许多可被归类为难以表达(DtE)，这可能对生物制药工业中治疗剂的递送提出挑战。DtE蛋白可以与低于预期的效价或与多链，辅助蛋白，产品回收或纯化的问题相关(Pybus等Biotechnol.Bioeng.111:372-85(2014))。DtE蛋白的示例包括但不限于，Fc-融合蛋白，双特异性或三特异性MAb，酶，膜受体，和双特异性T细胞接合物(Micromet AG公司，德国慕尼黑)分子和选定的mAb。

用于将重组蛋白(rP)表达盒整合到宿主细胞基因组的一种报道的方法基于随机整合(RI)，所述RI是通过将DNA导入细胞并合并于基因组中存在的双链断裂(DSB)的方法。因此，当使用这样的方法时，整合的基因拷贝数和整合位点处的表达特征(位置上色效果(position variegation effect))可以高度可变。出于许多原因，这对DtE蛋白来说可能会有问题。例如，对于一些多链蛋白，这将难以控制整合的编码单独链或辅助基因的基因拷贝数量，载体大小限制将阻碍多链蛋白的表达，转染多个载体将导致低整合效率和可能导致毒性的一些DtE的高表达。

用于整合rP表达盒的另一方法是通过使用位点特异性整合(SSI)。位于SSI细胞系基因组中的“着陆坪(Landing pad)”可以利用源自位点特异性重组酶系统，如源自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP-FRT系统或源自噬菌体P1的Cre-loxP系统的重组靶位点(RTS)。在这些系统中，重组的酶或重组酶负责供体和包含相容重组位点(分别为Frt或loxP)的靶DNA之间的重组事件(参见例如，Wirth等Curr.Op.in Biotech.18:411-9(2007))。通过使用位于待交换的盒(在供体和靶DNA中)5'和3'端的不同重组位点，有可能保证重组以定向的方式发生并且只有优选的盒区域被交换。因此，SSI可以比随机整合方法有利。将盒整合到SSI细胞系的过程被称之为重组酶介导的盒交换(EMCE)。实际上，用于使用EMCE产生重组蛋白的细胞系构建涉及共转染编码重组酶的表达载体以及靶向表达载体，所述靶向表达载体包含感兴趣的基因(编码rP)和侧接重组酶靶向序列的选择标志物。

使用单一着陆坪的产生SSI的细胞系也有局限性。例如，这样的方法通常，由于设计，导致可以间接限制rP产生重组蛋白表达效价的经整合的基因拷贝数量较少。如果对于rP产生需要在包含单一着陆坪的SSI宿主细胞系中产生多种蛋白质，那么所有需要的基因将需要包括在单一载体中。增加整合的重组基因拷贝的一种方法是累积SSI(有时候称为堆叠或多重，参见例如，Kameyama等Biotechnol.Bioeng.105:1106-14(2010)，Kawabe等Cytotechnology 64:267-79(2012)和Turan等J.Mol.Biol.402:52-69(2010))。藉由这样的方法，重复轮的RMCE可以用于加载单个位点，然后是rP表达盒拷贝的多个拷贝。这类SSI宿主细胞系中的着陆坪不能独立寻址，并且需要重复轮的RMCE，对于各循环将花费额外的时间。