[发明专利]细胞的表型表征

说明书

细胞的表型分析涉及将生物样品装载到包括细胞区室(20、120)的微流体装置(1、100)中，以将所述样品中包括目标细胞在内的生物材料捕获在所述细胞区室(20、120)中。将所述细胞区室(20、120)的子集(20A)鉴定为包含表现出目标表型特征的目标细胞，如基于在添加试验剂之前对所述细胞区室(20、120)中的生物材料的监测所确定的。使所述生物材料暴露于试验剂，并基于监测所述细胞区室(20、120)的所述鉴定的子集(20A)中的目标细胞来确定所述目标细胞对所述试验剂的表型反应。因此，所述目标细胞的表型分析不会被所述生物样品中存在的其他细胞和非细胞材料的反应掩盖。

技术领域

本发明的实施方案总体上涉及对细胞的表型表征，尤其涉及在微流体装置中对细胞的此类表型表征。

背景技术

随着抗生素抗性细菌的出现和传播日益增长，正确治疗感染的关键因素是能够快速有力地鉴定感染性物种的抗生素敏感性特征，以便确保使用有效的抗生素并减少对广谱药物的需要。目前，通过在存在和不存在抗生素的情况下进行表型分析，或通过对与先前观察到的表型抗性相关的遗传标志物进行基因型分析来检测细菌病原体对抗生素的抗性。

表型抗生素敏感性试验(AST)通常基于在液体培养物中或固体琼脂板上在有和无抗生素的情况下对差异性细菌生长的检测。在液体试验中，检测基于光密度的变化，而纸片扩散法用在固体琼脂板上鉴定抑制区。这些方法通常对于检测抗性和确定使细菌生长停止的抗生素浓度是可靠的，从而使其可以预测不同抗生素的治疗效用。然而，由于获得可靠的读数需要1-2天，因此这些方法无法提供有关如何在往往关键的早期感染阶段治疗患者的信息。因此，使医师面临开具广谱抗生素处方或冒第一处方抗生素将会无效的风险的艰难选择。

基因型AST基于通过使用常见遗传工具，例如通过聚合酶链式反应(PCR)进行的序列特异性扩增，通过挂锁探针介导的滚环扩增(RCA)或全基因组测序来检测与抗性表型相关的特定遗传标志物，如质粒、基因或突变。这些试验是高度敏感的，可以将检测时间限制为将选定的DNA序列扩增至可检测水平所需要的时间。然而，这些试验需要提前了解要测试的抗性标志物。如果出现新的抗性机制，这些标志物将不会被检测到并导致假阴性。此外，某些抗性基因/突变的存在不一定会转化为表型抗性。

与基因型AST不同，表型AST直接评估抗生素是否终止细菌生长，对于主治医师而言这是相关度最高的指标。因此，近年来开发了新的表型AST以减少检测时间。

通过检测液体培养物中16S rRNA的相对丰度而不是测量光密度，可以将AST检测时间缩减到几个小时。类似地，通过减小生长体积并应用z-堆栈成像来计算细胞占用率，AST的检测时间减少到～100分钟。

在过去几年中，微流体技术彻底改变了微生物单细胞的操纵和观察，而AST的一个富有成效的方向是使用微流体技术使细菌培养室微型化以增加信号背景比。基于微流体的简单AST方法的一个新近实例产生了浓度梯度并将其应用于30nL腔室中的小型细胞培养。对每60分钟获取的图像的分析允许检测180分钟内的最小抑制浓度(MIC)[1]。

进行有效的基于微流体的AST的一个限制是难以将细胞捕获或装载到微流体装置中。一种解决方案是装载与液体琼脂糖混合的细菌液体培养物，液体琼脂糖在冷却时固化并捕获细菌。在这种方法中，抗生素向微流体琼脂糖通道(MAC)的递送依赖于扩散，并且通过从相衬图像上跟踪单细胞生长速率来实现快速AST(通常1-4小时)。另一种解决方案建立在MAC成功的基础上，方式是将MAC移到96孔芯片上并将其与单细胞形态分析(SCMA)相结合。该方法允许同时鉴定多个物种对不同抗生素的不同反应，并且能够在60-120分钟内检测出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。