[发明专利]构建核酸分子拷贝的方法

说明书

公开了构建连续连接的核酸分子拷贝的方法。连续连接的核酸分子拷贝可用于对相同核酸分子进行数次测序，从而提高测序的总体准确性。连接的核酸分子拷贝可以通过环化5个核酸分子、进行滚环扩增和用包含5‑3外切核酸酶和/或活瓣内切核酸酶活性的切口和聚合酶脱支来构建。

较早申请的优先权要求

US 62/450,070申请日：2017年1月24日

US 62/451,734申请日：2017年1月29日

US 62/473,700申请日：2017年3月20日

US 62/506,706申请日：2017年5月16日

US 62/516,263申请日：2017年6月7日

US 62/576,974申请日：2017年10月25日

US 62/576,992申请日：2017年10月25日

序列表

包含本文所述DNA序列的命名为SequenceListing_2018TSAV0121_ST25.txt的文件的序列表是4KB大小，于2018年1月创建，并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本文提供的方法涉及核酸测序领域。

背景技术

核酸序列信息对于科学研究和医学目的是重要的。序列信息使得能够对疾病进行遗传易感性的医学研究，侧重于改变基因组的研究，例如癌组织的基因组，以及针对疾病的药物的合理设计。序列信息对于基因组学、进化和群体研究，基因工程应用和流行病学重要性的微生物研究也很重要。可靠的序列信息对于亲子鉴定和取证也很重要。

一直需要新技术来降低成本，提高测序输出的质量和数量。有可能通过简化流程和降低成本来彻底改变测序的有前途的技术基于纳米孔的检测。纳米孔是很小的孔，可以通过它们进行DNA转运，从而根据穿越DNA的序列导致离子电流的可检测中断。在使用纳米孔装置的单核苷酸分辨率下的测序以高报告错误率进行(Goodwin等，2015)。由于这些错误在测序期间随机发生，因此重复相同DNA链的测序程序若干次将基于来自重复读数的共有序列产生测序结果，从而提高总体准确度并降低总体错误率。

发明内容

本文公开的方法涉及核酸测序。公开了构建连续连接的核酸分子拷贝的方法。

本文公开的某些实施方案涉及构建包含核酸分子拷贝的脱支构建体的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：(i)通过附着核酸分子到至少一个衔接子来环化核酸分子，所述衔接子包含至少一个切口核酸内切酶识别位点的至少一部分；(ii)进行滚环扩增；(iii)暴露于识别所述识别位点的切口内切核酸酶，使得仅在(ii)中产生的构建体的双链区的一侧产生切口；和(iv)暴露于包含5'-3'外切核酸酶和/或活瓣(flap)内切核酸酶活性的聚合酶。在相关的实施方案中，可以对适于测序的衔接子进行步骤(iv)中产生的构建体的连接。

本文公开的其他实施方案涉及构建核酸分子拷贝的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：(i)进行滚环扩增；(ii)用溶解酶脱支，从而解离三元连结体和其他分支产物；和(iii)用包含5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶和/或连接酶处理，从而使带切口、有缺口或含有活瓣的产物免于进一步降解。