[发明专利]一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶重组菌，该重组菌为导入了谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌，其中所述的谷氨酸脱羧酶基因为来源于弓形链霉菌NRRL 15443的StGAD、链霉菌MJ654‑NF4的SsGAD或嗜铬链霉菌ATCC 49982的ScGAD，其核苷酸序列如SEQ ID No：1‑3所示。本发明采用弓形链霉菌NRRL 15443、链霉菌MJ654‑NF4和嗜铬链霉菌ATCC 49982作为菌株，通过PCR扩增技术从上述三种菌株的基因组上扩增得到了谷氨酸脱羧酶的编码基因：SsGAD、StGAD、ScGAD，利用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为宿主，成功构建了能够高效表达谷氨酸脱羧酶的重组菌，该工程菌经历至少10次的重复利用依然保持极高的转化效率。本发明还提供了上述重组菌的构建方法及该重组菌在制备GABA的应用，上述方法生产易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用。

背景技术

目前，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有调节血压、促进精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢、改善更年期综合征等多种功效。γ-氨基丁酸正被广泛应用于医药、食品保健、化工及农业等行业。GABA的生产可以通过化学合成和生物合成。由于化学合成反应条件剧烈，化学原料和溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，缺乏安全性，主要应用于化工行业，不适宜作为食品添加剂和医药。生物合成条件温和，专一性强、副产物少、安全性高，因此以生物合成法生产食品或者医药级的GABA是一条较为理想的途径。

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)是生物体内催化谷氨酸发生α-脱羧生成GABA的唯一的酶。目前已经在多种微生物中发现GAD的存在，利用微生物中的GAD催化谷氨酸生产γ-氨基丁酸不受资源、环境和空间的限制，具有显著的有点。目前利用基因工程中常利用过量表达谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量，工业上用的GAD大多是从各种微生物源中分离出来的，包括大肠杆菌、乳酸菌等，存在产量低，操作繁琐，经济效益等不足。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种适合大规模工业化生产的谷氨酸脱羧酶重组菌，采用将来源于不同链霉菌的SsGAD、StGAD、ScGAD克隆后在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)进行过量表达，生产谷氨酸脱羧酶。

本发明的目的之二在于提供了一种谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法。

本发明的目的之三在于提供了一种谷氨酸脱羧酶重组菌的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种谷氨酸脱羧酶重组菌，该重组菌为导入了谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌，其中所述的谷氨酸脱羧酶基因来源于弓形链霉菌NRRL 15443的StGAD、链霉菌MJ654-NF4的SsGAD和嗜铬链霉菌ATCC 49982的ScGAD，其核苷酸序列如SEQ ID No：1-3所示。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建质粒：将分别将SsGAD、StGAD、ScGAD经PCR扩增后，以pJET1.2作为基因克隆载体，将PCR扩增后的基因序列连接在其上，采用限制性内切酶针对酶切位点NdeI和HindIII进行酶切处理，分别将SsGAD结合物、StGAD结合物、ScGAD结合物连接到相应制粒上；

(2)构建重组菌：分别将上述步骤(1)中的目标质粒导入相应菌种中即得所述重组菌。