[发明专利]一种谷氨酸脱羧酶重组菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种谷氨酸脱羧酶重组菌，其特征在于，该重组菌为导入了谷氨酸脱羧酶基因的大肠杆菌，其中所述谷氨酸脱羧酶基因为来源于弓形链霉菌NRRL 15443的StGAD、链霉菌MJ654-NF4的SsGAD或嗜铬链霉菌ATCC 49982的ScGAD，其核苷酸序列如SEQ ID No：1-3所示。

2.一种如权利要求1所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建质粒：分别将SsGAD、StGAD、ScGAD进行PCR扩增，以pJET1.2作为基因克隆载体，将PCR扩增后的基因序列连接在其上，采用限制性内切酶针对酶切位点NdeI和HindIII进行酶切处理，分别将SsGAD结合物、StGAD结合物、ScGAD结合物连接到相应质粒上；(2)构建重组菌：分别将上述步骤(1)中的目标质粒导入相应菌种中即得所述重组菌。

3.根据权利要求2所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)的制粒为大肠表达质粒pET-28a(+)，分别得到目标质粒pHY6、pHW4、pHY1；上述步骤(2)将目标制粒pHY6、pHW4、pHY1导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中即得所述重组菌。

4.根据权利要求2所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中PCR扩增中SsGAD基因的引物序列为：

5′-AACATATGGCCTTGTACAAGGGCACCG

3′-AAAAGCTTTTAGTGGTGGAAGCCGGCGCGGACC；

StGAD基因的引物序列为：

5′-AACATATGGCTCTCCACAAGACGAAGGA

3′-AAAAGCTTTTAGTGGTGGAAGCCGGAGCGGGGA；

ScGAD基因的引物序列为：

5′-AACATATGCCACTCCACCAAGGCGCGGACA

3′-AAAGCTTTTAGTGGTGGAAGGCGGTGGCGGCC。

5.根据权利要求1所述谷氨酸脱羧酶重组菌的应用，其特征在于，包括将谷氨酸脱羧酶重组菌进行扩大培养以诱导其大量表达谷氨酸脱羧酶。

6.根据权利要求2所述谷氨酸脱羧酶重组菌的应用，其特征在于，所述重组菌的扩大培养中还包括向培养基中添加IPTG作为诱导剂的步骤，上述扩大培养过程为：将所述重组菌采用含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液，37℃，250rpm培养12小时，然后转入含有相同浓度卡那霉素的LB肉汤培养基中，37℃，250rpm培养至OD600达到0.4-0.6，添加IPTG诱导目标蛋白的表达，28℃，250rpm下持续培养16小时，收集培养液，离心，将获得的细胞体通过超声裂解后再次进行离心，取上清液即得目标蛋白。

7.根据权利要求2所述谷氨酸脱羧酶重组菌的应用，其特征在于，将所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法或所述谷氨酸脱羧酶重组菌的构建方法产生的谷氨酸脱羧酶应用于生产γ-氨基丁酸。