[发明专利]一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法

权利要求书

1.一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于，具体制备方法包括以下步骤：

S1、重组ORF2蛋白的表达：将pET-28a-ORF2转换大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养基中，培养过夜，次日取50uL菌液接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG,诱导8h后取样，同时诱导菌种pET-28a-BL21作为阴性对照，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达情况；

S2、重组ORF2蛋白的可溶性分析：取2uL重组菌种pET-28a-ORF2-BL21加入2mL含有卡那霉素LB培养基中，培养过夜，次日取1mL菌液接种于100mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入IPTG后分别于25℃、30℃和37℃诱导蛋白表达，诱导后，12000rpm离心20min收集菌体，用裂解缓冲液重悬，于冰水浴中超声破碎，将破碎后的产物12000rpm离心20min，沉淀用PBS重悬，分别取上清和沉淀做SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定蛋白可溶性；

S3、重组ORF2蛋白的纯化：使用镍柱亲和层析对可溶性的ORF2蛋白进行纯化，设置流速为1mL/min,使蛋白与层析柱充分结合，分别用250mM,500mM的咪唑洗脱目的蛋白，将收集到的蛋白液用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其组分，洗脱得到的ORF2蛋白立即放人PBS缓冲液中,透析72h,取20μL纯化过的蛋白样品,进行SDS-PAGE凝胶电泳染色前,进行Westemn blot分析,其中一抗选用PCV2阳性血清；

S4、纯化后得到检测试剂血清，对生产的检测试剂血清进行抽样检查，鉴定是否对圆环病毒2型有效。

2.根据权利要求1所述的一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于：所述超声破碎条件为：产生3秒，停三秒，超声时间为20min。

3.根据权利要求1所述的一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于：所述卡那霉素的浓度为30mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于：所述LB培养基的培养温度为37℃。

5.根据权利要求1所述的一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于：洗脱得到的ORF2蛋白立即放人PBS缓冲液中透析72h，期间4h更换一次PBS缓冲液。

6.根据权利要求1所述的一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于：所述检测试剂需要对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒进行检测，分析检测试剂是否与这些病毒的抗体产生交叉反应。