[发明专利]一种同时检测外泌体膜蛋白和mRNA的方法

说明书

一种同时检测外泌体膜蛋白和mRNA的方法，属于生物检测技术领域。该方法能够对同一样品分离纯化的外泌体，分别采用荧光抗体标记外泌体膜蛋白和分子信标标记外泌体包含的靶基因mRNA进行同时检测，其中分子信标标记外泌体具体采用外泌体原位捕获孔板或芯片进行检测，所述的外泌体原位捕获孔板中每孔或芯片上含有荧光素标记的分子信标，所述的分子信标为检测靶基因mRNA的特异性DNA探针。本发明运用了外泌体原位捕获孔板和芯片技术，检测生物样品中外泌体所包含的生物标志物基因mRNA。该技术具有灵敏度高、特异性强等优点。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测外泌体膜蛋白和mRNA的方法。

背景技术

外泌体（exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30-150 nm，具有脂质双层膜结构，能很好地保护其包被的物质。这种微小膜泡中含有宿主细胞来源的特异的蛋白、核酸和脂质，能作为信号分子传递给其他细胞，是细胞之间通讯的重要媒介，可使受体细胞发生多种生物学功能的改变。所有细胞均可产生外泌体，但不同细胞分泌的外泌体组份和含量不同，选择性地将特定的基因产物装入外泌体中，通过在不同细胞之间转移生物活性分子参与受体细胞的生物学功能调节。外泌体最有用的特性之一，其含量丰富，内含物来源特异、稳定，逐渐成为细胞生物学研究的新宠。

外泌体原位捕获孔板和芯片技术是一种全新的外泌体原位捕捉与检测技术，尤以检测外泌体中的mRNA和microRNA，以及外泌体膜蛋白见长。其以涂附有活化的生物分子膜玻璃为载体，包被有特异识别靶基因的mRNA或microRNA的分子信标（自行设计）的阳离子脂质纳米颗粒，其与带负电荷的外泌体融合后，分子信标与靶标结合，特异性荧光抗体与融合体上的膜蛋白结合，在激光的激发下而产生荧光信号，被全内反射荧光 (TIRF，totalinternal reflection fluorescence) 显微镜检测，信号强度与相应靶标含量成正比，从而判断病程或锁定病原体。由于TIRF成像具有超微，对荧光信号超敏感的特性，使得外泌体捕获孔板或芯片结合TIRF成像技术，可以实现对外泌体这种纳米级囊泡的直接成像及其内含物的半定量检测。由于外泌体在各种生物样品中大量存在，且其中富含特定细胞来源的特异性核酸，因此可以通过分离其中的外泌体，运用高度灵敏的外泌体捕获孔板和芯片检测技术加以鉴定。以肿瘤细胞来源的外泌体膜蛋白PDL1及其mRNA检测为例，其检测原理示意如图1所示。

该技术具有以下特征：

1、生物样品中，外泌体自身带负电荷，其包膜具有类似细胞膜的结构；

2、我们自制的包含有特异性分子信标的脂质纳米颗粒，自身带正电荷，其包膜也十分接近生物细胞膜结构；

3、在正负电荷的吸引下，外泌体极易与孔板或芯片上的纳米颗粒接触，二者随后发生膜融合，形成脂膜复合体，并很快达到电荷和体积平衡，不再融合更多的外泌体，实现原位定量捕获外泌体；

4、融合后，外泌体和纳米颗粒的内容物混合，特异性分子信标将与其靶基因mRNA或microRNA杂交，在激光的激发下而发出绿色荧光；

5、与此同时，外泌体原有的膜蛋白将发生重分布，但不影响其抗原性，当与特异性荧光抗体温浴后，二者将发生特异性结合，并在激光的激发下而发出橙黄色荧光；

6、这样，一个实验流程就实现了一个样品来源的外泌体膜蛋白和靶基因mRNA或microRNA的同步检测。

根据实验需要，外泌体捕获孔板或芯片可制作成24、48、96、384孔多种规格，每孔可包被单一或多种荧光素标记的分子信标，将多个靶基因检测通道集成在一块孔板或一张芯片上，以利于多样本高通量筛选，快捷、方便、经济，具有显著优势。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种可同时检测外泌体膜蛋白和mRNA的方法的技术方案。