[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及基因编辑材料，其包括如下步骤：S1、确定靶基因的sgRNA序列；S2、合成靶基因的sgRNA；S3、在蜂卵的尾部背侧或近头端腹侧显微注射编辑材料，以及进行注射卵的后期孵化；S4、注射卵靶基因的PCR扩增；以及S5、对步骤S4中获得的PCR扩增产物进行测序，以获得靶基因的基因编辑结果。其将蜜蜂基因编辑中的注射位点由尾部改为靠近头端的腹侧；同时首次在蜜蜂中使用sgRNA+Cas9蛋白混合物为基因编辑材料，高效地获得了G0代双敲Indel突变体，大大简化了培育双敲突变体工蜂的繁育过程，降低了蜜蜂基因编辑研究的生态风险。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料。

背景技术

蜜蜂是一种在授粉中发挥着重要作用的飞行昆虫，也是在整个生态系统中起着支撑作用的关键物种。

目前有关蜜蜂基因编辑成功的报导都是通过注射基因编辑原料(例如mRNA)到蜂卵的尾部来产生有基因编辑的性细胞，从而产生突变的后代来达到产生转基因蜜蜂的目的。但由于当卵裂细胞到达尾部时，胚胎本身的卵裂细胞总量已经是非常大了，因此产生基因编辑的细胞数量比较多，一个个体的后代就会有多种编辑体的出现，由此，对于筛选到单一的编辑体是比较困难的。而且，这种方式获得突变体后代的效率也非常低。

其次，为了获得目标基因双等位突变的工蜂，需要几代蜂的繁育过程，而该过程要求的技术难度相对比较高，经历的时间较为漫长。同时，期间会增加嵌合体蜂王逃逸的可能性，由此可能进一步引发因嵌合体蜜蜂逃逸而对生态环境带来的破坏。

因此，迫切需要创建一种高效的蜜蜂基因编辑技术。该技术可以在基因编辑处理后的当代(G0)个体就能产生双等位基因敲除的突变体，即完全突变体。这些完全突变的工蜂可以直接用于蜜蜂基因功能的研究等其他相关各种科学研究的需求。

发明内容

本发明针对现有基因编辑技术的上述缺陷，提供了一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料，其将蜜蜂基因编辑中的胚胎注射位点由性细胞存在的尾部改为合子形成的近头端腹侧，由此将编辑目标由性细胞转变成合子；同时首次使用sgRNA+Cas9蛋白混合物作为编辑材料，高效地获得了G0代双敲Indel突变体，大大简化了培育双敲突变体工蜂的繁育过程，降低了蜜蜂基因编辑研究的生态风险。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一方面，提供了一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法，其包括如下步骤：

S1、确定靶基因的sgRNA序列；

S2、合成靶基因的sgRNA；

S3、在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料，以及进行注射卵的后期孵化；

S4、注射卵靶基因的PCR扩增；

以及S5、对步骤S4中获得的PCR扩增产物进行测序，以获得靶基因的基因编辑结果。

优选的，所述靶基因为蜜蜂Mrjp1基因或Pax6基因。

优选的，步骤S3中，所述编辑材料为靶基因的sgRNA与Cas 9蛋白的混合物；当在蜂卵的尾部背侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白；当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白。

优选的，步骤S3中，当在蜂卵的尾部背侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白；当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。