[发明专利]检测SLC28A3基因rs885004位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒

说明书

本发明公开了一种SLC28A3基因rs885004位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用SLC28A3基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增SLC28A3基因片段，同时在SLC28A3基因特异性的引物界定的扩增区域内设计SLC28A3基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断SLC28A3基因rs885004位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SLC28A3基因rs885004位点多态性的分型检测方法与试剂盒。

背景技术

儿童期癌症是针对于儿童的癌症，近年来儿童癌症发病率正在逐渐增加。儿童癌症治疗方法的改进在过去几十年中大大提高了存活率，目前已超过80%。然而，长期治疗过程产生的并发症造成了大量患儿发病和死亡，尤其是心血管并发症和充血性心力衰竭。其中，蒽环类药物治疗是导致心血管病风险增加和心脏功能不全的主要原因之一。蒽环类药物诱导的心脏毒性（ACT）可表现为无症状的超声心电图异常或者是需要治疗的临床心力衰竭。已经确定了许多与ACT相关的临床风险因素，最重要的是ACT的发作呈现出剂量依赖性，累积用药剂量越高，发生ACT的风险就越大。

遗传因素也与ACT的发病相关。SLC28A3编码浓缩核苷转运蛋白，调节多种细胞过程，包括神经传递、血管张力、细胞表面受体附近的腺苷浓度以及核苷类药物的转运与代谢。SLC28A3基因中的rs885004（A/G）与ACT显著相关。进一步鉴定这些遗传风险因素可能会使ACT的低风险和高风险患者得到更好的分组，从而改善治疗和监测方案，提高癌症治疗的安全性，同时不影响生存。

目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。

分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。