[发明专利]2-酮基-L-古龙酸的发酵用培养基及2-酮基-L-古龙酸的发酵生产方法

说明书

本发明提供了一种2‑酮基‑L‑古龙酸的发酵用培养基，其含有0.007～0.009g/L的混合营养剂，所述混合营养剂重量百分比组成为：25～67％的细胞色素C和33～75％的血红素。本发明还提供一种2‑酮基‑L‑古龙酸的发酵生产方法，通过在发酵培养基中的混合营养剂浓度降至0.001～0.003g/L时补充加入所述混合营养剂，以维持其浓度在0.001～0.003g/L直至发酵结束，或者当在线溶氧值为20％～40％时补充加入吡咯喹啉醌使其在培养基中的浓度为0.003～0.005g/L，均可以缩短发酵周期、提高2‑酮基‑L‑古龙酸的合成效率。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型的2-酮基-L-古龙酸的发酵用培养基及2-酮基-L-古龙酸的发酵生产方法，使用该培养基和发酵生产方法可以提高2-酮基-L-古龙酸的合成效率、缩短发酵周期。

背景技术

维生素C(Vitamin C，简称VC)，即L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)，是人体必须从外界摄入的一种水溶性维生素，在医药、食品、化妆品、饲料等领域应用广泛。2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KGA)是合成维生素C的重要前体，目前“二步发酵法”依然是工业化生产VC的主要工艺，其中第二步混菌发酵是该工艺的关键技术，该技术只有在大菌(或伴生菌)的营养辅助下，小菌才能够正常生长代谢，合成相关的酶。其次，小菌利用细胞膜上的山梨糖脱氢酶将山梨糖转化为山梨酮，接着在山梨酮脱氢酶作用下将山梨酮转化为2-KGA，同时将从山梨糖和山梨酮脱下的电子经细胞膜上的电子传递链传递给氧气形成氧负离子，氧负离子与来源于山梨糖和山梨酮的氢离子结合，最终生成水。因此在该发酵工艺中，通过提高酶活与电子传递的效率来提高2-KGA的合成效率是非常必要的。

关于酶活的提高，专利文献1发现Fe³⁺、Mg²⁺和Ca²⁺能有效提高L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶的活性，但Cu²⁺则抑制L-山梨酮脱氢酶活性，过量的Cu²⁺导致发酵过程中巨大芽孢杆菌(B.megaterium)自溶，从而影响2-KGA的产量，而添加Mg²⁺和Mn²⁺则能有效抑制这一现象。因此，专利文献1通过在培养基中适当添加这些金属离子有效控制酶活而实现提高2-KGA产量的目的。

专利文献2也对培养基进行优化，通过添加还原型谷胱甘肽使菌体抵抗渗透压和维持体内正常的氧化还原环境的能力，促进混菌体系更好的适应发酵环境，提高酮古龙酸菌生物量。专利文献3则在大小菌全基因组的测序与功能注释的基础上，对大小菌糖代谢网络进行分析，发现并验证了一批可以在混菌发酵过程中被小菌很好利用并具有促进菌体生长的廉价碳源，如乙醇、乙醛及乙酸(盐)、D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖等。

关于电子传递效率的提高，专利文献4发现硫辛酸作为辅酶或辅基的组成成分，通过行使偶联酰基转移和电子转移的功能，在物质代谢中起重要作用。因此专利文献4通过在培养基中补充这种营养因子来提高酮古龙酸菌的生长和产酸能力。

现有技术文献：

专利文献1：CN101402988A

专利文献2：CN102424830A

专利文献3：CN104357529A

专利文献4：CN102321698B

发明内容

发明要解决的问题

本发明人对山梨糖代谢途径生产2-KGA进行了潜心研究，试图找到新的有效控制酶活和电子传递效率的关键物质，并利用该物质优化培养基和改进发酵生产方法。