[发明专利]基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法

说明书

本发明公开了基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，包括如下步骤:将基因过表达或干扰元件片段、荧光标记片段及抗性筛选片段依次插入到piggyBAC载体的ITR片段之间，构建载体，然后将构建的载体和pBase表达质粒共转染细胞，进行抗性筛选，选取抗性存活细胞，进行Q‑PCR检测，将pBase‑MU质粒转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间序列整体切除，原位点不残余任何序列，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。本发明的方法将基因过表达或干扰元件插入ITR之间，构建piggyBAC稳转载体。没有基因大小的限制，可以对较大的基因或多个基因同时进行过表达操作。

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法。

背景技术

研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过表达或者沉默该基因，筛选稳定细胞株。稳转细胞株在基因功能研究、信号通路研究、蛋白或抗体表达、药物开发等方面具有重要的作用。目前主要是通过病毒法构建稳转细胞株，其中最常用的是慢病毒。

慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。利用慢病毒的特性，将外源DNA 克隆到具有某种抗性的慢病毒载体中并感染宿主细胞，利用载体中所含的抗性标志进行筛选，可得到稳定表达或沉默特定基因的细胞株。

构建基因过表达或干扰稳转细胞株模型步骤如下：针对靶基因设计并构建过表达或干扰慢病毒载体；包装慢病毒，检测病毒滴度；慢病毒感染目标细胞，药物筛选富集阳性细胞；Q-PCR验证细胞系过表达或干扰效果。

现有技术的慢病毒转染方法的优点包括：(1)很多细胞系转染困难，慢病毒感染的方式能够实现高效的细胞转染；(2)载体中携带抗性基因，可以通过抗性筛选，去除部分野生型细胞，富集阳性细胞，提高过表达或干扰的效果；(3)慢病毒感染后，整合进细胞基因组，能够长时间稳定的实现过表达或干扰的效果。

但其也存在缺点，包括：

(1)慢病毒可能在基因组中整合多个拷贝，可能会影响到内源基因表达，也可能会造成基因组的不稳定；

(2)病毒感染可能会影响细胞的状态，引起细胞老化；

(3)慢病毒载体承载量有限，较大的基因慢病毒包装滴度低，导致细胞株构建困难；

(4)步骤繁琐：需要构建慢病毒载体，并进行病毒包装，稳转株构建周期很长；

(5)一旦基因整合后，就无法去除。

目前构建基因过表达或干扰稳转株的需求越来越多，急需一种更高效且能够实现去除的稳转株构建方法。

发明内容

针对上述现有技术存在慢病毒转染方法存在的缺陷，本发明提供 piggyBAC稳转株构建系统，实现了高效的进行基因过表达或干扰，并且可以进行切除逆转。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案是基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，包括如下步骤：

(1)载体构建:

将基因过表达或干扰元件片段、荧光标记片段及抗性筛选片段依次插入到piggyBAC载体的ITR片段之间，得到载体A；

(2)质粒转染和单克隆

将构建的载体A和pBase表达质粒共转染靶细胞，转染后，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞进行抗性筛选，挑单克隆进行培养； pBase表达后将ITR之间基因过表达或干扰元件片段转座插入基因组中，抗性基因表达使细胞存活，目标基因持续进行过表达或干扰；

(3)阳性克隆鉴定