[发明专利]基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法在审
| 申请号： | 201811619985.0 | 申请日： | 2018-12-28 |
| 公开（公告）号： | CN109628488A | 公开（公告）日： | 2019-04-16 |
| 发明（设计）人： | 郑敦武;段伟婷;程冬洋 | 申请（专利权）人： | 赛业（苏州）生物科技有限公司;赛业模式生物研究中心（太仓）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10 |
| 代理公司： | 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 | 代理人： | 范晴 |
| 地址： | 215400 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因过表达 构建 稳转细胞株 干扰元件 抗性筛选 系统构建 阳性克隆 切除 表达质粒 存活细胞 多个基因 荧光标记 基因 共转染 突变型 抗性 冻存 质粒 转入 细胞 成功 | ||
1.基于piggyBAC系统构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，包括如下步骤：
(1)载体构建:
将基因过表达或干扰元件片段、荧光标记片段及抗性筛选片段依次插入到piggyBAC载体的ITR片段之间，得到载体A；
(2)质粒转染和单克隆
将构建的载体A和pBase表达质粒共转染靶细胞，转染后，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，然后挑单克隆进行培养；
(3)阳性克隆鉴定
选前述的单克隆培养细胞进行Q-PCR检测，鉴定目标基因过表达或干扰的效果；
(4)表达元件切除
如需要将基因过表达或干扰元件片段去除时，将pBase-MU质粒转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间序列整体切除，原位点不残余任何序列，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。
2.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的基因包括小鼠、大鼠和人的所有外显子基因。
3.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的荧光标记片段选自GFP、mCherry、CFP、RFP或YFP能被荧光显微镜检测的基因。
4.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗性筛选片段选自嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或G418抗生素序列片段。
5.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述转染为电转染方式或脂质体转染方式。
6.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞选自哺乳动物细胞。
7.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，pBase表达质粒来自SBI公司PB210PA-1产品。
8.根据权利要求1所述构建基因过表达或干扰稳转细胞株的方法，其特征在于，pBase-MU质粒来自SBI公司PB220PA-1产品。
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