[发明专利]一种环孢霉素A免疫原的制备方法、环孢霉素A免疫原和抗环孢霉素A特异性抗体

说明书

本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法，属于酶联免疫检测技术领域，包括以下步骤：将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，得到环孢霉素A羧基衍生物；将得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联，得到环孢霉素A免疫原。采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原，再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体，该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A，与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种环孢霉素A免疫原的制备方法、环孢霉素A免疫原和抗环孢霉素A特异性抗体。

背景技术

环孢霉素A是一种高效免疫抑制剂，临床主要用于肝、肾、胰、心、肺、皮肤、角膜及骨髓移植，以减轻或防止排斥反应，提高患者的生存率和移植物的存活率。但由于其治疗窗狭窄，药动学参数个体差异大，低于有效浓度易引起排斥反应或诱发自身免疫性疾病，高于有效浓度则易引起感染或肝、肾及中枢神经系统损害。而且，CsA血药浓度水平易受性别、年龄、肥胖、肝功能、胃肠功能、药物相互作用以及饮食等众多因素的影响。因此，监测全血中CsA的血药浓度并调整其浓度在有效范围已成为临床合理使用CsA的重要方法。

目前已知的环孢霉素A(cyclosporine A,CsA)在体内的代谢产物有15种之多，主要以去甲环孢素，羟化环孢素及二羟化环孢素三种代谢物为主。因此在环孢霉素A的血药浓度监测过程中，特异性的测定CsA不受其代谢物的影响，是准确反映CsA药代动力学过程及安全用药的重要前提。

目前，体外测定环孢霉素A的方法主要高效液相色谱法，有放射免疫法(RIA)，化学发光免疫法(CLIA)，荧光偏振法(FPIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，胶乳增强比浊法。其中，高效液相色谱法，能够识别环孢霉素A及其类似物，但其设备昂贵，操作复杂，需要前处理，通量小，不适合在临床推广。而放射免疫法(RIA)，化学发光免疫法(CLIA)，荧光偏振法(FPIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，胶乳增强比浊法，均是基于抗原抗体的免疫反应原理，因此试剂使用的CsA抗体的特异性就决定了检测试剂对CsA药物监测的特异性。然而，目前已知多数商品化CsA测定试剂并不是特异性识别CsA，同CsA的主要代谢物，去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素存在较大的交叉反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环孢霉素A免疫原的制备方法，采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原，再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体，该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A，与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。

本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法，包括以下步骤：

1)将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，得到环孢霉素A羧基衍生物；

2)将所述步骤1)得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联，得到环孢霉素A免疫原。

优选的，所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为(8～12):(7～7.5)。

优选的，所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为10:7.23。

优选的，所述步骤1)环孢霉素A的质量与氯仿的体积比为(8～12)g:(35～45)ml。

优选的，所述步骤1)反应的时间为4.5～5.5h，所述反应在搅拌下进行，所述搅拌的速度为450～550rpm。

优选的，所述步骤2)环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白的质量比为(90～110):(45～55):(90～110)。

优选的，所述步骤2)载体蛋白包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。

优选的，所述步骤2)偶联的时间为2.5～3.5h。