[发明专利]一种基于特有识别序列的T细胞受体库高通量测序文库构建及测序数据分析方法

说明书

本发明公开了一种基于特有识别序列的T细胞受体库高通量测序文库构建及测序数据分析方法。该方法针对TCR恒定区C区mRNA序列设计了特异性逆转录引物，逆转录获得cDNA，再于cDNA的3’端连接带有特有识别序列的文库构建接头；然后使用夹板连接法添加上带有特有识别序列的接头，利用带有标签的基因特异性引物在DNA聚合酶的作用下扩增出TCR基因重排序列；最后通过PCR扩增使DNA文库加上测序接头，从而制备高通量测序cDNA文库并用于测序。通过生物信息学对TCR基因多样性进行全面分析，可精确高效获得包含J区、D区和V区基因TCR基因的重排规律。本方法建库效率高，建库步骤少，所需RNA起始量低，建库成本低。

技术领域

本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基于特有识别序列的T淋巴细胞受体库高通量测序文库构建及测序数据分析方法，应用于T细胞受体(T cell receptor，TCR)多样性检测。

背景技术

T细胞受体(T cell receptor，TCR)是介导特异性免疫应答的T细胞表面表达的可特异性识别抗原的分子。由αβ或γδ两条肽链构成的异二聚体，组成了95～99％的T细胞TCRαβ和1～5％的T细胞TCRγδ两种类型。外周血T细胞主要为TCRαβ的T细胞，是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。TCR序列具备类似于二维码结构的“溯源”能力，与TCR和细胞亚群的变异以及机体的健康状态有着密切关系。利用TCR序列信息有助于识别和靶向定位与致病性相关的T细胞亚群，为复合抗体、疫苗研发、肿瘤免疫治疗以及自身免疫系统疾病等研究提供数据信息。

α链和β链均属于免疫球蛋白超家族成员，其中，α链由70～80可变区(Variableregion，V)、61个连接区(joining，J)和1个恒定区(constant region，C)编码；β链由52个V、2个多样区(diversity，D)，13个J和2个C编码。其抗原特异性存在于V区；其有三个互补决定区(complementarities determining region，CDR)-CDR1、CDR2、CDR3，在T细胞发育过程中CDR1，2和骨架区(framework region，FR)相对保守，变异最大的CDR3区由V、D和J重排形成具有特异性抗原识别功能的包含2*10⁶～2.5*10⁸个TCR编码基因的T细胞受体库(TCRrepertoire)，决定着人的免疫系统如何适应环境的变化。此外，由于在重排的过程中，在V-D及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性。这种基因片段多样性的连接和重组重排使各种不同的抗原可以被其重排后的TCR识别。

随着高通量测序技术的高速发展，免疫学检测亦发展到新的高度，形成了以基因组和转录组等多种组学分析为核心的全方位分析技术，以便更加细致深入的了解T细胞特异性识别抗原的分子机制。目前对TCR基因多样性的检测主要是二代测序技术，llumina测序平台的测序错误率约为1/1000，虽然远低于其他测序平台，但仍然无法区分PCR/测序错误引入的假阳性突变和真实突变，低于5％的突变无法进行检测。因此在不进行纠错的情况下，二代测序可以对含量在5％以上的突变进行检测。达到这个分辨率通常需要数千倍的覆盖度。因此成本上无法对全基因组进行检测，只能对特定的区域/位点进行靶向测序检测。

目前用于TCR基因检测的靶向测序技术，主要有两大技术类型，多重PCR(multiplex PCR，MPCR)和cDNA 5′端的快速扩增法(5′Rapid amplification of cDNAends，5′RACE)。多重PCR存在着较高的扩增偏向性和测序错误；其次对于DNA损伤和PCR引入的错误无法识别，因而准确性较差，且检测结果有存在假阳性的可能。AMP技术是基于5′RACE原理的一种技术，可以有效降低错误率和扩增偏差，但是存在着末端修复加A和第二链合成等操作繁琐的步骤。

因此，从临床适用性上来讲，精确确定个体的免疫受体组库对预后、诊断和表征均具有极大的意义，建立一种可对扩增偏差和测序错误进行矫正的方法对准确评估TCR的多样性十分必要。

发明内容