[发明专利]一种基于特有识别序列的T细胞受体库高通量测序文库构建及测序数据分析方法

权利要求书

1.一种带有特有识别序列的T细胞受体高通量测序文库构建接头元件，其特征在于，所述接头元件为带有粘性末端的发夹结构的DNA寡核苷酸，DNA序列从5’到3’依次包含茎环发夹序列A、识别序列RS、固定序列FS、发夹序列B和随机序列，发夹序列A和B互补形成发夹的茎结构，接头元件的5’末端带有磷酸基团修饰，3’末端带有氨基基团修饰；所述接头元件的识别序列RS包含4～15个随机排列组合的核苷酸；接头元件的固定序列FS为Illumina/Life文库PCR引物的识别序列；所述接头元件为一条两端序列互补的DNA寡核苷酸，通过高温变性后退火形成发夹结构；所述接头元件为含有不同随机排列组合核苷酸序列的识别序列RS的发夹结构DNA寡核苷酸的混合物；

上述带有特有识别序列的T细胞受体高通量测序文库构建接头元件从5’→3’方向的序列为：GTGTATCCAGTGNNNNNNNNGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACCACTGGATACACNNNNNN，如SEQID NO:1所示，其中GTGTATCCAGTG为发夹序列A，NNNNNNNN为识别序列RS，GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAAC为固定序列FS，CACTGGATACAC为发夹序列B，NNNNNN为随机序列；发夹序列A和B互补，通过高温退火形成发夹的茎结构，同时使随机序列突出形成粘性末端；固定序列FS为Illumina/Life文库PCR引物的识别序列；N表示A、T、C、G中任意一种碱基，不同位置的N为相同或不同的碱基；5’带有PO₄修饰，3’带有NH₂修饰。

2.一种对T细胞受体进行高通量测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)T细胞受体测序文库的构建方法：

S1：提取样本的总RNA：使用Trizol试剂或商品化试剂盒提取总RNA；

S2：使用与TCR恒定区序列互补的TCR特异性引物进行逆转录，获得TCR链完整cDNA分子；所述TCR特异性引物的核苷酸从5’→3’方向的序列为CAGAGGTGCTCTTGGAGGAG，如SEQ IDNO.2所示；

S3：使用夹板连接法(splint ligation)将权利要求1所述的接头元件使用T4连接酶连接到步骤S2所述cDNA的3′端；

S4：cDNA纯化：使用Beckman核酸纯化试剂盒对步骤S3获得的cDNA进行纯化；

S5：cDNA的靶向扩增：所述靶向扩增上游引物的核苷酸从5’→3’方向的序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA，如SEQ ID NO:3所示，其中GTTCAGAGTTCTACAGTCCGA与权利要求1所述的接头元件中的固定序列FS互补结合；所述靶向扩增下游引物的核苷酸从5’→3’方向的序列为GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACTCCTCCAAG AGCACCTCTG，如SEQ ID NO:4所示，其中，CTCCTCCA AGAGCACCTCTG与步骤S2所述的特异性引物互补，GTGACTGGAGTTCCTT GGCACCCGAGAA TTCCA为Illumina/Life文库PCR引物的识别序列；通过靶向扩增获得两端带有Illumina/Life文库PCR引物的识别序列的DNA；

S6：DNA纯化：使用Beckman核酸纯化试剂盒对步骤S5获得的DNA进行纯化；

S7：DNA的PCR扩增：所述PCR扩增引物为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5，其中SEQ ID NO.5的核苷酸从5’→3’方向的序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA，其中GTGACTGGAGTTCCT TGGCACCCGAGAATTCCA为Illumina/Life文库PCR引物的识别序列；

S8：PCR产物纯化：使用Beckman核酸纯化试剂盒对步骤S7获得的DNA进行纯化；

S9:使用Illumina高通量测序平台MiSeq PE250进行测序；

(2)对(1)构建的T细胞受体测序文库测序数据分析方法：

S1：对下机数据进行质量控制，去除含有低质量碱基的序列、去除测序读N碱基的序列和截掉相应的测序接头；

S2：利用接头中的固定序列，寻找到特有识别序列的位置，并对特有识别序列进行序列解析；

S3：reads聚类：把带有相同特有识别序列的reads作为一个聚类(cluster)；在每一个cluster中，通过计算reads之间的序列相似性，进行再次聚类，得到亚聚类(sub-cluster)：相似度高于95％的reads聚为一个亚类，似度低于95％的reads归入不同的亚类中；

S4：reads的一致性归并：将每个sub-cluster下面的reads进行多序列比对和一致性归并，最终得到一条一致性read；在一致性归并的过程中，来源相同的分子的重复reads最终被归并为一条序列，达到去重的目的；同时，同一sub-cluster中的reads在PCR扩增或上机测序过程中引入的错误碱基也会基于多条reads的一致性序列被纠正，从而实现去除重复和纠正错误的双重目的；

S5：测序过程中特有识别序列同样会引入错误，因此对相同一致性reads的特有识别序列进行相似性比较，将相似性高于90％的特有识别序列进行合并，达到特有识别序列纠错的目的；

S6：使用MiXCR软件，即Bolotin DA 2015，将通过一致性归并获得的所有reads序列与国际免疫遗传学数据库IMGT中的V、D、J基因片段进行比对，其网址为http://www.imgt.org/，确定每条一致性序列的TCR组成，包括V、D、J基因使用情况，TCR重组中随机插入和删除的碱基；

S7：V、D、J基因功能注释：根据IMGT中V/J基因功能注释、CDR3区域长度和CDR3编码产物，判断TCR重排序列是否具备功能，并统计TCR功能分类；

S8：根据TCR的比对结果，统计V和J基因及V-J基因对使用频率，寻找不同样本间表达模式差异，并计算样本TCR组成多样性；

优选地，采用Shannon’s entropy，Simpson’s index和D50(Wu J 2015)计算样本TCR组成多样性：

Shannon’s entropy计算公式：

Simpson’s index计算公式：

其中：s表示实际观测到TCR重组序列数目；pi表示第i个TCR重排序列在所有TCR中所占的比例；

将样本中所有TCR重排序列按照在样本中所占比例从高到低进行排列，然后按照这个顺序将TCR序列所占比例依次相加，当相加比例达到样本的一半时，此时所相加的TCR重排序列数目即为D50，D50值越大，说明样本TCR多样性越高。