[发明专利]一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，其特征在于：所述工程菌株命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因组中含有多拷贝内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1，其基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β-葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。

2.权利要求1所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，步骤是：将内切葡聚糖酶2的基因(egl2)表达盒与pMD 19-T载体连接，得到融合基因表达载体pTeg2；再将该载体转化进出发菌里氏木霉QM9414的基因组，即获得内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株；随后将含有β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)表达盒的质粒pTHB，转化入内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株的基因组中，筛选、验证即可获得内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌QMEB5；其中，所述egl2基因其上游为内切葡聚糖酶2启动子Peg2，下游为内切葡聚糖酶2终止子Teg2；bgl1基因其上游为外切葡聚糖酶1启动子Pcbh1，下游为外切葡聚糖酶1终止子Tcbh1；所述egl2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述bgl1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1来自里氏木霉RUT-C30基因组；所述的eg2的启动子Peg2和终止子Teg2来源于里氏木霉QM9414；所述的bgl1基因的启动子Pcbh1和终止子Tcbh1来源于质粒PTHB。

4.权利要求1所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌在发酵生产纤维素酶中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵生产纤维素酶的方法是：

将基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5接种到装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，30±2℃，转速为180-220rpm，培养24-36h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按0.5-1g湿菌丝转接到100mL发酵培养基的比例扩大接种，继续培养120-168h，然后以9000-13000rpm，4℃离心5-10min收集上清液，即得到含纤维素酶的酶液；其中，

所述种子培养基的组成成分为：葡萄糖10g/L，玉米粉15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄15g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L；

所述发酵培养基的组成成分为：结晶纤维40g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄，5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L，CaCO₃ 2.5g/L，甘油2.5g/L，Tween-802g/L。

6.权利要求1所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌发酵产生酶液在水解玉米芯材料中的应用。