[发明专利]一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法

说明书

本发明公开了一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，包括灌流液配制步骤、乳鼠主动脉逆行灌流步骤、心肌组织的分离步骤；其特征在于通过针头的连接使得胶原酶液持续地经主动脉‑冠脉系统充分灌流至心肌组织。本发明将胶原酶液经主动脉‑冠脉系统灌流至心肌组织，相较于大多科研人员所采用组织‑酶消化法来分离大鼠乳鼠心肌细胞，本法所获得的心肌细胞存活率高，细胞状态好，分离后不仅能进行原代心肌细胞培养，还能即刻进行膜片钳、单细胞染色和共聚焦显微镜成像、活细胞工作站动态观察与参数分析等后续实验操作，而传统的组织‑酶消化法若进行上述膜片钳等实验操作需将分离获得的细胞纯化和培养48小时以上心肌细胞恢复其原有形态后方可进行。

技术领域

本发明属于心脏病学研究的应用技术领域，具体涉及一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法。

背景技术

目前，大鼠心肌细胞的分离方法可以分为机械收集法、Langendorff离体灌流法和组织-酶消化法，其中目前Langendorff离体灌流法较为常用，且主要应用于成年大鼠的心肌细胞分离。相较于另外两种方法，Langendorff离体灌流法急性分离成年大鼠心肌细胞，能提高心肌细胞分离后的存活率，细胞状态稳定、功能良好，且急性分离获得的细胞更接近活体的生理状态，实验结果更具说服力。

大鼠乳鼠指出生后0-7天的大鼠，其心脏体积较小，目前欲对乳鼠心肌细胞分离多采用组织-酶消化法，即：将大鼠乳鼠的心脏取出、漂洗后，用眼科剪剪成约1mm³的小组织块，加入胰蛋白酶液或胶原酶液或混合酶液后，温箱或水浴锅中孵育、消化一定时间后，吸取上清液，所取上清液中反复用巴氏吸管吹打使其中细胞充分吹散、无细胞团块后加入终止液，终止消化后即可在显微镜下观察到圆形心肌细胞(如图1-1所示，组织块-酶消化法分离得到的丧失原有形态的心肌细胞和细胞团(球状，如箭头所指)和成纤维细胞；如图2所示，组织块-酶消化法分离得到的心肌细胞(圆形)和成纤维细胞，必须再经过培养方可恢复形态)。组织块-酶消化后也可用差速贴壁法分离纯化和离心新生鼠细胞，以获得更高浓度的细胞悬液，此法需重复操作多次，步骤繁琐，所需时间较长，会增加细胞的死亡和降低获取的细胞浓度，由于细胞分离完成后，心肌细胞丧失了原有的杆状形态，若要进行膜片钳测定细胞离子通道状态或活细胞工作站观察细胞功能需将细胞进行48-72小时培养，整体时间较长。

现阶段Langendorff装置离体灌流主要应用于成年大鼠的心肌细胞分离，且技术逐渐成熟，在肉眼直视下将针头插入成年大鼠主动脉近心端并进行灌流、酶消化后，可获得大量的心肌细胞，且可于梯度复钙、贴壁后直接用于膜片钳、共聚焦显微镜等后续实验。

但尚未见有文献报道将Langendorff灌流应用于乳鼠心肌细胞的分离。本发明将Langendorff离体灌流操作技术应用于大鼠乳鼠心肌细胞的分离，所获得的心肌细胞的形态学和功能状态优于机械收集法和组织-酶消化法。但是，本法分离乳鼠心肌细胞时，要求心脏在离体后2min之内完成插管并开始灌流，对于实验者的操作技术要求更高，且常需要在他人的协助下完成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，将大鼠乳鼠的心脏急性分离为含单个心肌细胞的细胞悬液，所获得的心肌细胞存活率高，细胞状态好，分离后即能进行膜片钳、单细胞染色的共聚焦显微镜成像、活细胞工作站动态观察与分析等后续实验操作。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，包括灌流液配制步骤、乳鼠主动脉逆行灌流步骤、心肌组织的分离步骤；其特征在于通过针头的连接使得胶原酶液经主动脉-冠脉系统充分灌流至心肌组织，且灌流液体流速均匀、持续也不超过2mL/min。