[发明专利]一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法

权利要求书

1.一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于它包括灌流液配制步骤、乳鼠主动脉逆行灌流步骤、心肌组织的分离步骤；其特征在于通过针头的连接使得胶原酶液经主动脉-冠脉系统充分灌流至心肌组织，且灌流液体流速均匀、持续且不超过2mL/min。

2.根据权利要求1所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于所述灌流液体为KR液或PBS、KH液、Hanks液、无钙台氏液中的一种；所述胶原酶液是以灌流液体为分散液，按0.2-1mg/mL CollagenaseⅡ或CollagenaseⅠ胶原酶的浓度配制的胶原酶液；所述心肌组织的分离步骤中的消化酶解后的心肌细胞保存液为KB液或Hanks液、无钙台氏液、KH液中的一种；所述心肌组织的分离步骤中的消化酶解终止液是以心肌细胞保存液为分散液，按0.1-1mmol/L的EGTA或EDTA浓度，或按0.2-2mg/ml的BSA浓度配制的酶解终止液。

3.根据权利要求1所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于针头选择20-26g的平口钝头针头；或者选取20-26g的注射器针头，留取1-3cm针体将针头剪断，将针头断端磨平即可。

4.根据权利要求2所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于所述KR液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠35±0.5，氯化钾4.75±0.05，磷酸二氢钾1.19±0.03，磷酸氢二钠16±0.3，蔗糖134±1，碳酸氢钠25±2.5，葡萄糖10±2，HEPES 10±1，并用氢氧化钠将KR液的pH调至7.4±0.2；所述KH液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠118±0.5，氯化钾4.7±0.05，磷酸二氢钾1.19±0.03，碳酸氢钠25±2.5，葡萄糖10±2，并用氢氧化钠将KH液的pH调至7.4±0.2；所述PBS液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钠137±0.5，氯化钾2.7±0.05，磷酸氢二钠10±2，磷酸二氢钾1.8±0.3，并用氢氧化钠将PBS液的pH调至7.4±0.2；所述Hanks液中各组分浓度按照mmol/L计为：氯化钾5.4±0.1，磷酸二氢钾0.44±0.01，氯化钠137±0.5，磷酸氢二钠0.34±0.01，葡萄糖5.5±1，碳酸氢钠4.2±0.2，并用氢氧化钠将Hanks液的pH调至7.4±0.2。

5.根据权利要求2所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于所述KB液中各组分浓度按照mmol/L计为：牛磺酸10±0.1，谷氨酸70±1，氯化钾25±0.25，磷酸二氢钾10±0.5，葡萄糖22±1，至到并用氢氧化钾将KB液的pH调至7.2±0.05。

6.根据权利要求2所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于主动脉逆行灌流操作过程，具体如下：将大鼠乳鼠的心脏夹持至预冷的心脏灌流液中漂洗，放在装有预冷心脏灌流液的培养皿内，在体视显微镜下找到主动脉断端口；装有心脏灌流液的注射器针筒与平口钝针头连接，然后将该平口钝针头缓慢插入主动脉内1-4mm；接着将针头固定在主动脉内，按不超过2mL/min的速度匀速、持续推注或泵注心脏灌流液；灌注心脏灌流液不超过7min后，夹持针头固定在主动脉残端内，拔出针筒，连接装有胶原酶液的针筒，按不超过2mL/min匀速、持续推注预热的胶原酶液4-20min，拔出针头，即完成主动脉逆行灌流操作。

7.根据权利要求1所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于主动脉逆行灌流所用器械主要包括注射器、注射器平口钝针头、显微持针钳和体视显微镜。

8.根据权利要求1所述的一种急性分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，其特征在于心肌组织的分离步骤，具体过程如下：将完成主动脉逆行灌流操作的乳鼠心脏夹持入1-10ml预冷的消化酶解终止液中，剪碎成组织块，用巴氏吸管在消化酶解终止液中反复吹打，直至液体呈浑浊悬液；静置后，将沉淀物剪碎再次加入预冷消化酶解终止液再次吹打，可重复1-5次，吹打后所得上清液，即获得心肌细胞悬液；将所获得的细胞悬液离心后，去上清，加入心肌细胞保存液液后保存。