[发明专利]一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法

说明书

本发明属于水产生物基因工程领域，公开了一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法，根据克隆得到厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长序列设计siRNA，采用不同参数设置分析不同脉冲模式对甲状腺素受体基因的敲减情况；收集电穿孔转染后96h的幼虫，提取幼虫RNA；设计甲状腺素受体基因引物，利用荧光定量PCR检测甲状腺素受体基因的表达情况。本发明与未加siRNA和无义siRNA处理后进行比较，结果显示加入甲状腺素受体基因siRNA显著降低了该基因的表达量，敲减效率近100％。

技术领域

本发明属于水产生物基因工程领域，尤其涉及一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

厚壳贻贝Mytilus coruscus是广泛分布于我国沿海的海水经济贝类，隶属于软体动物门双壳纲，是我国重要的养殖经济贝类，我国浙江省嵊泗县是厚壳贻贝的主产区。厚壳贻贝个体大，肉质肥美，是含优质蛋白质的双壳贝类海产品，营养价值高，深受我国沿海地区人民的喜爱。

厚壳贻贝的苗种供应主要来源于人工育苗，幼虫附着变态是人工育苗中非常重要的一个阶段，若幼虫不能完成正常变态，则会出现大批量死亡现象。目前，厚壳贻贝人工繁殖技术中所存在的问题一直没有得到解决，育苗成活率和苗种品质一直不稳定，导致苗种供不应求。例如，浮游幼虫附着变态率低，且在附着变态阶段出现大规模死亡现象等问题。然而，海产贝类幼体的基础科学研究和遗传改造手段还远远不能满足应用研究的需要。海产贝类幼体的获得具有一定季节性，受精卵数量多且个体小，幼体成活率低，使得目前一直未建立一个稳定、高效的研究方法。

综上所述，现有技术存在的问题是：

通量低（换句话说就是在短时间无法完成大量无脊椎动物幼体的基因编辑技术），例如显微注射。

成本高，例如脂质体混合siRNA转染虽然通量较显微注射高，但是其价格非常昂贵（1.5 ml约2-4千元人民币），且转染效率在甲壳类藤壶中为60%。低与本方案中的双壳贝类厚壳贻贝。

目前基因敲除/敲减技术是通过对特定基因进行永久沉默或阻止其表达的方法。在海产贝类幼体中，显微注射因效率低且难以重复而极少使用。基于化学转化在海产贝类幼体研究中的报道也很少，例如，脂质体因价格昂贵而难以推广使用。电穿孔方法相比具有简便、相对稳定等优点。而目前对于利用电穿孔技术在海产贝类幼体中进行基因敲减的研究仍不成熟。本领域需要建立一种能够高效、稳定的电穿孔敲减基因表达的方法，观察特定靶基因缺失后的表型，并研究可能进一步对相关生命现象所造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。

解决上述技术问题的难度和意义：

解决上述技术问题的难度在于进行活体实验，也就是把厚壳贻贝的幼体通过电穿孔的方法仍能保持大量幼虫存活，并且基因敲减的效率能达到最优。在贝类中并没有任何报道，也没有相应所建立的针对在贝类幼体中依赖于电穿孔的方法；

意义：本发明需要建立一种能够在贝类中高效、稳定的电穿孔敲减基因表达的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法。本发明提高了转染的通量，也就是在短时间内可以对很多幼虫进行基因编辑，而且不需要脂质体，降低了转染的成本。

本发明是这样实现的，一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法，所述厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法包括：

眼点幼虫的筛选：将厚壳贻贝从担轮幼虫在培养箱中培养至眼点幼虫阶段；

siRNA电穿孔转染:对所筛选的眼点幼虫经无菌过滤海水清洗；将厚壳贻贝眼点幼虫转移至含有无菌过滤海水和厚壳贻贝甲状腺素受体基因siRNA的电击杯中；进行方波脉冲处理；待眼点幼虫复苏后，转移至自然海水中培养，收集眼点幼虫样品用于RNA提取用于荧光定量PCR验证；