[发明专利]一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法有效
| 申请号： | 201811562874.0 | 申请日： | 2018-12-20 |
| 公开（公告）号： | CN109456994B | 公开（公告）日： | 2021-05-11 |
| 发明（设计）人： | 李一峰;梁箫;程之扬;陈珂;竹攸汀;杨金龙 | 申请（专利权）人： | 上海海洋大学 |
| 主分类号： | C12N15/87 | 分类号： | C12N15/87;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401 | 代理人： | 杨采良 |
| 地址： | 200000 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 贻贝 眼点 幼虫 穿孔 转染 方法 | ||
1.一种厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法，其特征在于，所述厚壳贻贝眼点幼虫的电穿孔转染方法包括：
眼点幼虫的筛选：将厚壳贻贝从担轮幼虫以5个/ml幼虫密度并在18℃培养箱中培养至眼点幼虫阶段；每两天更换一次海水，海水温度为18℃，海水经混合纤维膜过滤，盐度为30‰；选用壳长为320 μm、壳宽280 μm且形状规则的眼点幼虫用于电穿孔转染；
siRNA电穿孔转染:对所筛选的眼点幼虫经无菌过滤海水清洗；将100-300只厚壳贻贝眼点幼虫转移至含有1 ml无菌过滤海水和0.4 μg或0.8 μg厚壳贻贝甲状腺素受体基因siRNA的0.4 cm伯乐电击杯中；进行方波脉冲处理；待眼点幼虫复苏后，将眼点幼虫转移至18℃的自然海水中培养96 h，96 h后收集眼点幼虫样品用于RNA提取用于荧光定量PCR验证；
所述0.4 cm伯乐电击杯的体积为1.5 ml；
所述方波脉冲处理的参数设置为：一次5 ms的100 V电场脉冲，然后是十次20 ms的50V电场脉冲，每次脉冲电压之间间隔1 s；
所述眼点幼虫复苏的时间为：5~10 min；
所述siRNA是根据厚壳贻贝甲状腺素受体基因全长设计的长度为21 bp的双链siRNA5′-GCUGAAAUCCUGCUGUUUAtt-3′，无义siRNA5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3′；
所述荧光定量PCR验证为：采用引物对对所述厚壳贻贝甲状腺素受体基因及两个内参基因EF-1α和α Tubulin的表达进行分析；
所述引物对为：
TR-F TCAACTTCATCCTCATCGTCAC；
TR-R CGCATCAGTACACACAACACAT；
EF-1α-F CACCACGAGTCTCTCCCTGA；
EF-1α-R GCTGTCACCACAGACCATTCC；
α Tubulin-F TTGCAACCATCAAGACCAAG；
α Tubulin-R TGCAGACGGCTCTCTGT。
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