[发明专利]基于酿酒酵母CRISPR文库的工业酿酒酵母抗逆性改造

说明书

本发明设计并构建了适用于酿酒酵母的sgRNA文库(该sgRNA文库包含针对抗逆调控库中的一种或多种基因、细胞生长及代谢调控库中的一种或多种基因和/或分子及转录水平调控库中的一种或多种基因的sgRNA)，将该sgRNA文库应用于环境条件诱导的酿酒酵母适应性进化过程中，通过将CRISPR/Cas9系统的高效定向编辑与环境条件诱导的适应性进化联合，特别是借助酿酒酵母非同源末端连接(NHEJ)修复机制进行全基因组“改写”，大大推动了酿酒酵母的整体进化，获得了具备多重抗逆性(抵抗工业物料压力、温度压力和乙醇压力)的工业酿酒酵母。

技术领域

本发明涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CRISPR文库的设计与构建以及应用该文库促进微生物适应性进化的方法，属于生物化工领域。

背景技术

目前工业生物技术产品的年产值在逐年增长，在国民经济中占有很高比重，其中，微生物发酵是工业生物技术的主要组成部分。然而，现有发酵工业中，工业微生物常受高糖、高温、产物积累等发酵微环境胁迫。例如，包括酿酒酵母在内的酵母是生物产业领域非常重要的微生物细胞工厂，具有易培养、细胞生长周期短、遗传背景清晰等优点，是理想的真核生物模式菌种。作为工业生产的优良菌种，酿酒酵母能通过糖酵解途径将葡萄糖转化为乙醇。随着基因工程技术的发展，酿酒酵母被改造成工程菌用于生产各类天然产物，使酿酒酵母的应用性更为广泛。就此而言，发酵微环境胁迫会对酵母细胞产生多种影响，如错误折叠蛋白的积累、氧化磷酸化的解偶联、质膜与细胞骨架结构的破坏以及细胞蛋白分泌途径的缺失等，这些都严重影响酵母细胞的生长及代谢。提高酿酒酵母的鲁棒性，使其在多变的培养环境、较高的发酵温度下仍保持正常的生长代谢活力，成为改进酵母发酵工艺的重中之重。

目前工业上主要通过发酵工艺优化(例如培养条件的人为调控)来降低胁迫，但该方法不仅增加发酵成本，而且消耗资源。因此，从源头出发提高工业微生物自身的抗逆性可有效抵抗胁迫，可以更好地发挥其作用。对此，虽然近年来国内外通过微生物的抗逆机制进行理性设计和适应性进化能够使微生物具有一定的抗逆性，但所得成果比较局限，主要集中于细胞单一抗逆性研究(例如耐高温胁迫或耐乙醇胁迫等)，难以获得响应工业发酵微环境的多重抗逆性，并且当前研究多以实验室模式菌株为研究对象，在实际工业应用中仍然受到限制。

整体来说，迄今为止，就提高微生物本身的抗逆性而言，国内外学者主要从适应性进化和基于现有抗逆机制进行理性设计这两方面开展了研究。近几年已经开发了结合原生质体融合的基因组重排技术(Genome shuffling)、改造基因组范围转录调控程序的全局转录机制工程(Global transcription machinery engineering，gTME)、基因组复制工程辅助的连续进化(Genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE)、基因组多重位点自动改造技术(Multiplex automated genome engineering，MAGE)等育种技术来提高微生物的抗逆性。

虽然目前基于环境条件诱导的传统适应性进化技术在提高微生物抗逆性方面呈现出一定效果，但如上所述，这种单一环境条件的传统适应性进化技术耗时、低效、工作量大；另一方面，基于现有抗逆机制进行理性设计，即，基于分子层面的构建方法针对性强，但不同胁迫环境响应不同的耐受机制，且不同耐受机制间又存在错综复杂的交互关系，造成针对某一耐受机制的理性设计结果往往并不显著，同时也并非所有的微生物特性都能通过理性的技术进行改造，缺乏一定的普适性。