[发明专利]一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物高产D-木糖酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D‑木糖酸方法，是以大肠杆菌W3110为出发菌株，连续敲除其内源性基因获得工程菌E.coli XGL2；将构建的重组质粒pETPtac‑xylBC导入E.coli XGL2中，得到能高产D‑木糖酸的工程大肠杆菌E.coli XGL2/pETPtac‑xylBC；再以玉米芯水解液为底物，生物发酵E.coli XGL2/pETPtac‑xylBC，由发酵液得到D‑木糖酸。实验证实本发明方法能够生产获得D‑木糖酸91.2g/L，得率为1.05g D‑木糖酸/1g D‑木糖，生产效率为1.52g/[L·h]，为工业化生产D‑木糖酸并充分利用玉米芯提供了新途径。

技术领域

本发明涉及一种发酵生产D-木糖酸的方法。尤其涉及一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸的方法。

背景技术

玉米芯是第二大农作物废料(Kumar V et al.,Bioresour.Technol.,2018,251:416-419)，仅我国的玉米芯年产量就超过4千万吨(中国农业资源与区划.2016,37:1-8)。玉米芯经过简单处理后，可以形成富含木糖和少量葡萄糖的玉米芯水解液(Koqje A et al.,3Biotech,2016,6:127；Cai D et al.,Bioresour.Technol.,2016,211:677-684)，后者主要被用于制备D-木糖和木糖醇。相对于年需求量为24万吨的木糖醇来说，产能过剩的玉米芯如果处理不当则会造成环境问题(Zhang H et al.,Bioresour.Technol.,2018,257:223-228；Venkateswar Rao L et al.,Bioresour.Technol.,2016,213:199-310；Chen Met al.,Carbohyd.Polym.,2008,71:411-415)。因此，迫切需要开发新的玉米芯利用技术，以缓解玉米芯产量不断增多造成的环境压力。

D-木糖酸是一种五碳有机酸，可以应用在很多领域，例如食品、工业、医药等行业(Y et al.,Metab.Eng.,2011,13:383-391；Toivari MH et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,96:1-8；Ma J et al.,Green Chem.,2016,18:1738-1750)。它还可以作为前体物质，用于1,2,4-丁三醇、1,4-丁二醇、3,4-二羟基丁醛、3,4-二羟基丁酸等重要化学品的生产(Zhang N et al.,Enzyme Microb.Technol.,2016,93:51-58；Wang J et al.,Metab.Eng.,2017,41:39-45；Liu H et al.,Metab.Eng.,2015,29:135-141)。由于其广泛的用途和工业化生产潜力，因此被美国能源部门评为前三十种重要化学品之一(Cao Y et al.,PLoS One,2013,8:e67305)。

根据文献报道，目前微生物法生产D-木糖酸的主要菌株包括筛选得到的野生菌和代谢工程改造后的基因工程菌。天然野生菌包括葡萄杆菌属、肠杆菌属和假单胞菌属等(Buchert J et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,1988,27:333-336)。基因工程菌包括代谢工程改造后的酿酒酵母、大肠杆菌等。例如，Toivari等人在酿酒酵母中外源表达了里氏木霉中的木糖脱氢酶(xyd1)，生产了3.8g/L D-木糖酸(Toivari MH et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,96:1-8)，后续又在具有水解液耐受性的酿酒酵母中敲除醛糖还原酶(GRE3)，又表达来自月柄杆菌的木糖脱氢酶(xylB)后，生产了43g/L D-木糖酸(Toivari M et al.,Metab.Eng.,2012,14:427-436)。Liu等人在大肠杆菌W3110中进行代谢工程改造，并外源表达xylB，实现了39.2g/L的D-木糖酸积累(Liu H et al.,Bioresour.Technol.,2012,115:244-248)。