[发明专利]一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物高产D-木糖酸的方法

权利要求书

1.一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，步骤是：

(一)以大肠杆菌W3110为出发菌株，用代谢工程手段对其改造：采用一步法敲除技术连续敲除木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙酸激酶基因ackA、特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG和β-半乳糖苷酶基因lacZ，获得的工程菌命名为Escherichia coli XGL2；将构建的重组质粒pETPtac-xylBC导入Escherichia coli XGL2中，获得在Escherichia coli XGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC；

(二)以玉米芯水解液为底物，生物发酵步骤(一)获得的工程大肠杆菌Escherichiacoli XGL2/pETPtac-xylBC，由发酵液得到D-木糖酸；

其中，所述发酵条件是：培养温度为37±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600±50转/分钟，通气量为1.0±0.1vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0±0.4，培养时间为36～60小时；

玉米芯水解液成分中D-木糖与D-葡萄糖的含量比例在6:1～12:1，D-木糖含量不低于40g/L；不使用IPTG诱导，使用乳糖进行诱导。

2.根据权利要求1所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，其特征在于，步骤(一)所述工程大肠杆菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC的构建方法是：

(1)采用中拷贝、含强启动活性Tac启动子的pETPtac表达载体外源表达来自月柄杆菌(Caulobacter crescentus)中木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC，构建得到重组质粒pETPtac-xylBC；其中，所述木糖脱氢酶的xylB基因序列长度为747个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述木糖酸内酯酶的xylC基因序列长度为870个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)采用基因工程手段在野生型大肠杆菌W3110中敲除内源性木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF，阻断内源性D-木糖及D-木糖酸代谢途径，得到工程大肠杆菌，命名为E.coli X3；其中：所述大肠杆菌内源性木糖异构酶基因xylA核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述木糖酸脱水酶基因yjhG核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述木糖酸脱水酶基因yagF核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)采用基因工程手段在E.coli X3菌株中敲除内源性乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB和乙酸激酶基因ackA，阻断乳酸、乙醇的生成途径，削弱乙酸的生产途径，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XG4；其中，所述内源性乳酸脱氢酶基因ldhA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述乙醇脱氢酶基因adhE核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；所述丙酮酸氧化酶基因poxB核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述乙酸激酶基因ackA核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(4)采用基因工程手段在E.coli XG4菌株中敲除内源性磷酸转移酶系统中特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG，消除碳源代谢阻遏，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XGL1；所述葡萄糖转运蛋白基因ptsG核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

(5)采用基因工程手段在E.coli XGL1菌株中敲除内源性β-半乳糖苷酶基因lacZ，阻断乳糖降解途径，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XGL2；所述内源性β-半乳糖苷酶基因lacZ核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

(6)在E.coli XGL2菌株中导入步骤(1)所述重组质粒pETPtac-xylBC，获得在E.coliXGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC。